Использование FE-SEM 8500 для получения высококачественных изображений биологических образцов

Введение

Биологические образцы охватывают широкий диапазон размеров, состава, структур и морфологий.

За последние десятилетия два взаимодополняющих направления микроскопии в исследовании биологических образцов выдвинулись вперед, образуя конфокальную лазерную сканирующую микроскопию и сканирующую электронную микроскопию (СЭМ). Многие биологические образцы разделяют схожие параметры, являющиеся для СЭМ проблемными, например низкая электропроводимость и необходимость размещения на предметных стеклах.

Образцы, исследуемые в СЭМ, обычно обладают электропроводимостью, минимизируя накопление заряда образца. Накопленный заряд способен привести к появлению дефектов на изображении. Достижения СЭМ, направленные на исследование биологических образцов, позволили создать более яркие источники света, катоды с полевой эмиссией а также низкий вакуум, которые, в свою очередь, привели к появлению сканирующего электронного микроскопа с естественной средой и СЭМ низкого напряжения. Для минимизирования зарядки образца существует три способа. Первым способом является покрытие образца инертным металлом, к примеру золотом. Второй заключается в повышении давления в камере, чтобы молекулы газа нивелировали заряд. Третий способ предполагает уменьшение напряжения электронного пучка(LV-SEM), чтобы энергия на заряд в нем находилась в равновесии.

Биологические образцы обычно имеет низкую электропроводимость и хрупкую структуру,  что создает опасность накопления заряда  и повреждения электронного пучка. Единственным способом преодоления этих трудностей является использование СЭМ низкого напряжения. Тем не менее, съемка СЭМ низкого напряжения приносит хорошие изображения низкого разрешения. Чтобы улучшить разрешение и контраст СЭМ, повышается яркость источника и понижается стартовый размер детектора с помощью полевой эмиссии.

Agilent 8500 FE-SEM – полевой эмиссионный сканирующий электронный микроскоп низкого напряжения, представляющий новейший дизайн электростатических линз. Данный инновационный дизайн позволяет получать изображения биологических образцов высокого разрешения, исключая необходимость в металлическом покрытии. 8500 FE-SEM применяется для съемки следующих типов биологических образцов: диатомовые водоросли, человеческие волосы, тонкий кишечник мыши, а также клетки и бактерии.

Диатомы

Диатомы являются большой группой водорослей и одним из самых распространенных типов фитопланктона. Несмотря на то, что диатомы являются одноклеточными, они также могут существовать колониями  (Fragillaria,Meridion, Tabellaria, Asterionella). Характерной особенностью диатомовых клеток является нахождение внутри уникальной клеточной стенки, состоящей из силикатов. Они различаются по форме, однако, как правило, состоят из двух ассиметричных сторон и промежутка между ними. Данные, полученные из ископаемых, позволяют отнести их возникновение к раннему юрскому периоду. Диатомовые колонии являются популярным и полезным инструментом для наблюдения за условиями окружающей среды, как в прошлом, так и на сегодняшний день. Также, с их помощью проводят исследования качества воды.

Биоминерализация кремния диатомами также может оказаться полезной для нанотехнологий. Диатомовые клетки способны постоянно производить структуры и поры различных форм и размеров. Это потенциально может позволить диатомам производить наноразмерные структуры, которые будут применяться в различных устройствах. При помощи соответствующего искусственного отбора, в лаборатории можно будет разработать диатомовые водоросли, производящие структуры определенного размера и формы для дальнейшего массового производства наноразмерных компонентов.

LV FE-SEM используется для получения изображений диатомовых водорослей, расположенных на изоляционной ленте, поглощающей углерод (изображения 1-3).

Agilent SEM

Снимки диатомовых образцов были получены с применением 1кВ ускоряющего напряжения, без покрытия и без проблем с накоплением заряда.

Исследование человеческого волоса

Желание людей иметь красивые и ухоженные волосы позволило развиться огромной индустрии продукции по уходу за волосами. Благодаря технологии ухода за волосами развились функции очистки, защиты и восстановления волос путем изменения физических и химических характеристик их структуры. Шампунь используется для очистки волос, а кондиционер покрывает волосы тонкой пленкой для защиты, придания желаемой красоты и ощущения комфорта. Успех косметической продукции базируется не только на качествах, но и на способе взаимодействия с биологическим образцом.

Agilent SEM

Большинство людей, имеющих и каштановые и серые типы волос, ощущают определенные различия  между пигментированными (изображения 4-5) и непигментированными (серыми) (изображения 6- 7) волосами.  Ощущаемые различия, в сущности, конструктивны: серые волосы являются более жесткими и неуправляемыми. У одного из испытуемых, седые волосы оказались жестче каштановых, поскольку их диаметр был больше на 36%. Эти результаты согласуются с данными предыдущих исследований и наводят на мысль, что продукция по уходу за волосами, направленная на изменение состава серых волос, вряд ли будет эффективна в исправлении их жесткости.

Кишечник мыши

Тонкая кишка является частью пищеварительной системы, где еда разрушается до мельчайших компонентов, а питательные вещества всасываются. Тонкая кишка мыши является животной моделью, используемой для понимания процесса нарушения пищеварения и возникновения инфекционных заболеваний. Для получения изображений микроворсинок в тонкой кишке мыши использовался LV SE-FEM с 1кв ускоряющего напряжения (изображения 8-10) На изображении 10 мы можем увидеть поперечные срезы нескольких ворсинок.

Agilent SEM

Неподвижные клетки

Идентификация и характеристика подструктур клеток в высоком разрешении требует применения электронной микроскопии. Возможен широкий диапазон увеличений: от 10 кратного ( что эквивалентно увеличению под лупой) до 500000, что в 250 раз выше возможностей лучших световых микроскопов. СЭМ позволяет проводить прямое наблюдение макромолекулярных структур. Из-за узкой направленности пучка электронов, полученные микроснимки имеют большую глубину резкости, дающую возможность трехмерного проецирования, которое в свою очередь, помогает в понимании структуры поверхности образца. Компромисс с оптической микроскопией состоит в том, что СЭМ воспроизводит лишь статические изображения неподвижных образцов, и тем самым, лишен возможности предоставления достоверной информации  о клеточной и белковой динамике.  Исследование активных процессов и анализ белковой динамики серьезно продвинулись вперед благодаря развитию молекулярной биологии, где посредством оптической микроскопии стала возможной визуализация помеченных флуоресцентных фрагментов специфических белков в реальном времени. Поэтому LV FE-SEM является отличным дополнением для клеточных биологов, позволяя им проводить наблюдение и описание морфологии поверхности и подструктур, недоступные оптической микроскопии. Различные типы клеток, снятые при помощи LV FE-SEM (1кв ускоряющего напряжения) можно увидеть на изображениях 11-16.

Agilent SEM

Бактерии

Bacillus megaterium являются грамположительными, палочковидными бактериями, которые используются в сельском хозяйстве в качестве почвенного модификатора. Данные бактерии образуют схожие со стрептобациллой цепочки. Bacillus megaterium являются одними из крупнейших эубактерий, находящихся в почве. Группы данных бактерии часто находят в цепях, где клетки соединены между собой полисахаридом, располагающимся на стенках. Bacillus megaterium способны выживать в разных экстремальных условиях за счет образования спор. Bacillus megaterium производят фермент, используемый для изготовления пенициллина. Они также способны производить ферменты для модификации кортикостероидов и аминокислот.

Agilent SEM

Bacillus megaterium являются хорошим источником промышленного белка, потому что идеально подходят для клонирования и производят широкий спектр ферментов. Данный вид идеален для клонирования, так как способен вместить бесчисленное множество искусственных плазмидов (векторов), оставаясь стабильным, за счет уникальных внешних протеаз. Биотехническое рассмотрение Bacillus megaterium обеспечивает обилие различных белков, которые используются в важных медицинских, научных и промышленных исследованиях. Вы можете видеть Bacillus megaterium на изображениях 17-19, полученных при помощи LV FE-SEM (1кв ускоряющего напряжения).   

Разработанные клеточные субстраты

Современные технологии исследования клеток “в пробирке” столкнулись с такой проблемой, как невозможность исследования in vivo (на живой ткани при живом организме). В реальности, “живые” клетки функционируют в трехмерной структуре или ткани, где находятся в тесном контакте с соседними клетками. Клеточный рост и жизнеспособность повышаются при увеличении оксигенации и при большем коэффициенте ПДМС (изображения 20-22). Обычно подобные клетки требуют покрытия их металлом для исследования с помощью СЭМ (изображение 20). Однако, металлическое покрытие скрывает морфологию поверхности клетки. LV FE-SEM способен вести наблюдение за образцами без необходимости обязательного покрытия (изображения 21-22) Без металлического покрытия, изображения морфологии поверхности клетки отчетливо видны.

Agilent

Заключение

LV FE-SEM обеспечивает передовой метод получения изображений неподвижных биологических образцов в высоком разрешении. Несмотря на то, что биологические образцы разделяют огромный диапазон размеров, состава и структур, их морфологические особенности легко возможно исследовать с помощью Agilent 8500 FE-SEM.