Требования к разрешающей способности цифровой камеры для оптической микроскопии

Качество изображений, проецируемых оптическим микроскопом на фотодиодную матрицу ПЗС или КМОП-формирователя изображений, зависит от целого ряда факторов, начиная с коэффициента увеличения, числовой апертуры и разрешающей способности объектива и, заканчивая, размерами фотодиодной матрицы электронного формирователя изображений, соотношением сторон, коэффициентом увеличения видеосоединителя и размерами отдельных светочувствительных элементов матрицы. Кроме того, необходимо учитывать параметры конкретного образца, например, контрастность, отношение сигнал/шум, внутрикадровый динамический диапазон и время интегрирования.

Для подробного ознакомления с медицинской и исследовательской техникой основных мировых производителей оптических систем и сопутствующего оборудования посетите наш каталог или свяжитесь с нашими специалистами и получите полную профессиональную консультацию по любым, имеющимся у Вас, вопросам. 

Предельная разрешающая способность матрицы ПЗС является функцией количества имеющихся в ней фотодиодов, а также их размера относительно изображения, проецируемого на поверхность матрицы объективом микроскопа. Размеры предлагающихся на рынке матриц ПЗС колеблются от нескольких сотен до многих тысяч пикселей. Современные матрицы, использующиеся в научно-исследовательских приборах, содержат от 1000×1000 до 5000×5000 светочувствительных элементов. Тенденция в производстве бытовых и профессиональных ПЗС-камер состоит в непрерывном уменьшении размеров фотоэлементов, благодаря чему сегодня доступны цифровые камеры с фотодиодами 4×4 микрона.

Для достижения адекватного разрешения образца, визуализируемого оптической системой микроскопа, нужно сделать, минимум, две выборки для каждой разрешимой единицы, хотя, чтобы достичь достаточного разрешения, многие пользователи предпочитают делать три выборки на разрешимую единицу. В ограниченных дифракцией оптических приборах, таких, как микроскопы, предел Аббе для оптического разрешения объектива с числовой апертурой 1,4 на средней длине волны видимого диапазона (550 нанометров), составляет 0,20 мкм. Таким образом, фотодиод площадью 10 квадратных микрометров имеет размер, достаточный для обеспечения необходимого оптического и электронного разрешения, а предпочтительным является фотодиод с размерами 7×7 мкм. Хотя, меньшие фотодиоды в ПЗС-фотоприемнике и улучшают пространственное разрешение, они, при этом, ограничивают динамический диапазон устройства.

Табл. 1. Требования к размерам пикселей для согласования с оптическим разрешением микроскопа

Объектив

Обычно, в микроскопии изображение проецируется оптической системой на поверхность фотоприемника, которым может быть сетчатка человеческого глаза, электрический видеосенсор или светочувствительная эмульсия традиционной фотопленки. С целью оптимизации информационного содержимого конечного изображения, разрешающие способности фотоприемника и микроскопа должны полностью совпадать. Волновой спектр видимого света, использующегося для создания изображения образца, — это один из определяющих факторов разрешающей способности микроскопа. Короткие волны (375–500 нанометров) позволяют различать детали с большей степенью разрешения, чем более длинные (длиннее 500 нанометров). Кроме того, границы пространственного разрешения определяются дифракцией света в оптической системе; обычно, этот параметр называют дифракционно-ограниченной разрешающей способностью. Соотношения между числовой апертурой, длиной волны и оптической разрешающей способностью описываются следующими уравнениями:

r = λ/(2 • NA) (1)

r = 0.61 • λ/NA (2)

r = 1.22 • λ/(NAоб + NAконд) (3)

где r — разрешающая способность (наименьшее различимое расстояние между двумя объектами), NA — числовая апертура объектива, λ- длина волны, NA(об) — числовая апертура объектива, а NA(конд) — числовая апертура конденсора. Уравнения (1) и (2), как можно заметить, различаются множителем, равным 0,5 для уравнения (1) и 0,61 — для уравнения (2). Эти уравнения получены с учетом многих факторов, включая теоретические расчеты в области оптики, с учетом характеристик объективов и конденсоров, но не должны рассматриваться как некий общий физический закон. Предположение, что два точечных источника света могут быть разрешены (визуализированы по отдельности), в том случае, когда центр диска Эйри, формируемого одним из этих источников, перекрывается с отражением первого порядка в дифракционной картине второго диска Эйри, представляет собой условие, известное, как критерий Рэлея. В некоторых случаях, например в конфокальной и многофотонной флуоресцентной микроскопии, разрешающая способность может, в действительности, превышать установленные любым из этих трех уравнений пределы. Другие факторы, такие как низкая контрастность образца и неправильное освещение, могут лишь понизить разрешающую способность, поэтому реальное значение r (около 0,20 мкм при средней длине волны спектра 550 нанометров) и числовая апертура от 1,35 до 1,40 редко достижимы на практике.

При идеальной юстировке микроскопа и соответствии между объективом и конденсором, в уравнения (1) и (2) можно подставить числовую апертуру объектива, при этом, уравнение (3) сведется к уравнению (2). Стоит заметить, что увеличение не входит ни в одно из этих уравнений, поскольку на разрешение образца влияют только числовая апертура и длина волны освещения. Как уже упоминалось (и видно из уравнений), длина волны света является важным фактором, определяющим разрешающую способность микроскопа. Коротковолновое освещение дает более высокое разрешение (меньшие значения r), и наоборот. Наибольшая разрешающая способность в оптической микроскопии достигается при использовании излучения ближней ультрафиолетовой области, на самой короткой из эффективных волн визуализации. По способности различать детали образца за ближним ультрафиолетовым излучением следует голубой, за ним зеленый и, наконец, красный свет. В большинстве случаев, для освещения образца в микроскопии применяется белый свет, излучаемый галогенной лампой с вольфрамовой нитью. Середина видимого спектра приходится на длину волны около 550 нанометров, основную длину волны зеленого света (к этому свету наиболее чувствительны глаза человека). Именно эта длина волны использовалась при расчетах разрешающей способности для учебного пособия и таблицы 1. Немаловажное значение в этих уравнениях имеет и числовая апертура, увеличение которой влечет повышение разрешающей способности (см. таблицу 1).

Отношение сигнала к шуму в приборах с зарядовой связью

Отношение сигнала к шуму (С/Ш) характеризует качество измерений и определяет предельные характеристики любой электронной измерительной системы. В отношении ПЗС-фотоприемника (прибор с зарядовой связью), значение С/Ш представляет собой отношение измеренного уровня светового сигнала к совокупному уровню шума, который состоит из возникающих в электронной системе паразитных компонентов сигнала и, присущих фотонному потоку, естественных флуктуаций. Поскольку ПЗС-фотоприемник аккумулирует заряд дискретных физических элементов, отношение сигнал/шум можно рассматривать, как отношение амплитуды сигнала к погрешности измерения, применительно к каждому пикселю. В ПЗС-системе формирования изображений имеют место три основных вида шумов (помех): фотонный шум, темновой шум и шум чтения. Все эти шумы необходимо учитывать при вычислении отношения сигнал/шум.

При запуске учебного приложения отображается график отношения сигнал/шум в зависимости от времени интегрирования для гипотетической ПЗС-системы, обладающей типичными характеристиками высококачественных камер, использующихся для визуализации в микроскопии. В моделируемой учебным приложением системе можно изменять (при помощи мыши и ползунков, расположенных под рабочим окном), параметры, влияющие на отношение сигнал/шум ПЗС-фотоприемника. При изменении любой переменной, в желтом окне слева происходит обновление расчетного значения отношения сигнал/шум. В процессе формирования изображения электронным фотоприемником, включая ПЗС, случайные флуктуации интенсивности сигнала создают шум, который накладывается на сигнал. С ростом амплитуды шумов возрастает погрешность измерения сигнала. Изменение факторов, непосредственно влияющих на уровень сигнала, оказывает обратное действие на отношение сигнал/шум, чем изменение тех параметров, которые вносят основной вклад в совокупность шумов, что и отражается в индицируемом значении. Высокое отношение сигнал/шум оказывает сильное влияние на получение высококачественных изображений, и особенно критично в приложениях, требующих световых измерений прецизионной точности. Селективные кнопки Binning Factor (Коэффициент бининга) позволяют улучшать отношение сигнал/шум по методу, широко использующемуся в ПЗС-камерах научно-исследовательского уровня. При использовании бининга, сформированный сигналом заряд групп смежных пикселей объединяется при считывании в более крупные «суперпиксели». Коэффициент бининга представляет собой количество пикселей, которые объединяются и образуют больший пиксель. При повторном вычислении отношения сигнал/шум, уже с учетом бининга, предполагается, что сигналы всех пикселей группы одинаковы.

Выходной (измеряемый) сигнал ПЗС-системы формирования изображений, который используется для определения отношения сигнал/шум, зависит от падающего на ПЗС фотонного потока (выражается в фотонах за секунду на один пиксель), квантового выхода устройства, (где 1 представляет КПД = 100%) и времени интегрирования (экспонирования; в секундах), в течение которого регистрируется сигнал. Произведение этих трех параметров определяет сигнал (числитель) отношения сигнал/шум, который сравнивается со всеми шумами, суммарный уровень которых является знаменателем упомянутого отношения. Регулятор под названием Quantum Efficiency (Квантовый выход) в окне приложения обеспечивает диапазон регулировки от 20% до 98%; регулятор Photon Flux (Фотонный поток) позволяет задать уровень падающего света в диапазоне от 0,1 до 10000 фотонов в секунду на один пиксель. Регулятор Integration Time (Время интегрирования) задает время интегрирования сигнала ПЗС-устройством в интервале от 0,1 до 100 секунд.

Кроме того, в приложении имеются регуляторы Read Noise (Шум чтения) (среднеквадратичное значение от 2 до 20 электронов на пиксель) и Dark Current (Темновой шум) (от 0,01 до 50 электронов в секунду на один пиксель). Фотонный шум, вносящий свой вклад в общий уровень помех, является функцией уровня сигнала и не представляет собой независимую шумовую переменную, которую можно было бы уменьшить за счет изменения конструкции или принципа работы камеры, но также включается в расчет отношения сигнал/шум. В желтом числовом поле справа (Detected Photons/Pixel (Зарегистрированные фотоны/пиксель)) индицируется суммарное количество сигнальных фотонов, считанное с каждого пикселя матрицы ПЗС за период интегрирования, заданный соответствующим регулятором. Это значение равно произведению фотонного потока, квантового выхода и времени интегрирования. Пять регуляторов, в сочетании с несколькими селективными кнопками, обеспечивают диапазон отношений сигнал/шум, соответствующий большинству рабочих условий, которые могут возникнуть при использовании ПЗС-камер, предназначенных для микросъемки в условиях низкой освещенности. При первой загрузке или после возврата исходных значений учебного приложения ползунки регуляторов по умолчанию устанавливаются в положения, типичные для охлаждаемой ПЗС-камерынаучно-исследовательского класса.

Ниже кратко характеризуются три основные шумовые составляющие сигнала, которые ухудшают рабочие характеристики устройства визуализации за счет уменьшения отношения С/Ш и учитываются при вычислении общего отношения сигнал/шум.

Фотонный шум (иногда называемый дробовым) обусловлен имманентной статистической изменчивостью частоты поступления фотонов, падающих на ПЗС-устройство. Генерируемые полупроводниковым устройством фотоэлектроны формируют сигнал, амплитуда которого возмущается флуктуациями, описываемыми пуассоновским статистическим распределением фотонов, падающих на данный участок ПЗС. Таким образом, фотонный шум, или разброс измерений, равен квадратному корню из амплитуды сигнала.

Темновой шум порождается статистическим непостоянством количества тепловых электронов, образующихся в кремниевой структуре ПЗС. Это количество не зависит от фотонно-индуцированного сигнала, и очень сильно зависит от температуры устройства. Скорость формирования тепловых электронов, при данной температуре ПЗС-устройства, называется темновым током. Подобно фотонному шуму, темновой шум находится в статистической связи с темновым током и, равен квадратному корню из количества тепловых электронов, генерируемых за время экспонирования изображения. Охлаждение ПЗС-устройства резко уменьшает темновой ток. На практике, высококачественные камеры охлаждаются до температуры, при которой темновой ток в пределах типового интервала экспонирования ничтожно мал.

Шум чтения представляет собой комбинацию составляющих системного шума, присущих процессу преобразования носителей заряда в ПЗС-устройстве в сигнал напряжения (с целью квантификации), а также последующей обработки и аналого-цифрового преобразования. Основной вклад в шум чтения вносит находящийся на кристалле предварительный усилитель. Этот шум равномерно добавляется к каждому пикселю изображения. В высококачественных камерах применяются конструктивные усовершенствования, существенно снижающие значение шума чтения.

Отношение сигнал/шум в учебном приложении вычисляется по следующей формуле: С/Ш = PQet / [ PQet + Dt + Nr2 ]½, где P — падающий фотонный поток (фотонов в секунду на пиксель); Q(e) — квантовый выход ПЗС-устройства, t — время интегрирования (секунды), D — сила темнового тока (электронов в секунду на пиксель); N® — шум чтения (среднеквадратичное число электронов на пиксель).

Анализ показывает, что вышеприведенное уравнение представляет собой отношение суммарного сигнала, формируемого за время экспонирования, деленного на совокупный шум, связанный с описанными выше тремя шумовыми составляющими. Эти три составляющие шума не связаны друг с другом, поэтому в знаменатель входят соответствующие значения каждой из составляющих: корень квадратный из сигнала определяет фотонный шум, темновой шум равен квадратному корню из произведения темнового тока и времени интегрирования, а корень квадратный из N® во второй степени соответствует шуму чтения.

Вычисление отношения сигнал/шум по вышеприведенной формуле предполагает, что сигнал обусловлен только одним источником света. Различные паразитные источники фонового освещения, например, рассеяние света в системе формирования изображений, могут вносить свой вклад в результирующий шум. Если такой вклад значителен, то к фотонному шуму необходимо добавить фоновый фотонный поток (B), в соответствии со следующей формулой: С/Ш = PQet / [(P + B)Qet + Dt + Nr2 ]½

Еще один, подлежащий учету фактор, состоит в том, что значения падающего и фонового фотонных потоков, равно как и квантовый выход, являются функциями длины волны. Поэтому, в случае использования источников освещения с широким спектром излучения, вычисление отношения сигнал/шум требует интегрирования этих переменных по всем длинам волн, использующимся для формирования изображения. В высококачественных ПЗС-системах формирования изображений используются различные методы повышения отношения сигнал/шум. Для снижения скорости генерирования в полупроводниковых структурах ПЗС-устройства теплового заряда (который проявляется в виде темнового тока), иногда используются специальные технологии изготовления и режимы использования этих устройств. С целью снижения темнового тока до ничтожно малого уровня общепринято подвергать ПЗС-камеры термоэлектрическому или криогенному охлаждению. В случае необходимости, возможен даже экстремальный метод охлаждения жидким азотом. В общем случае, темновой ток высококачественных ПЗС-фотоприемников уменьшается в два раза при снижении температуры на каждые 5 — 9 градусов Цельсия ниже комнатной. Этот параметр называется «температурой удвоения». Такой темп снижения темнового тока сохраняется до температуры в 5 — 10 градусов ниже нуля. При дальнейшем понижении температуры уменьшение темнового тока быстро ослабевает. Для снижения уровней некоторых составляющих шума чтения, кроме специальных схемных и конструктивных решений, иногда используется техника фильтрации при помощи усовершенствованных интеграторов и методы двойной выборки.

Рис. 1. Зависимость отношения "сигнал/шум" от времени интегрирования

Поскольку фотонный шум является неотъемлемым свойством регистрации сигнала ПЗС-устройства, этот шум невозможно устранить за счет конструктивных решений, и он, по сути, представляет собой «собственный шум» или минимально достижимый уровень шума, относительное влияние которого снижается с увеличением фотонного потока. Поэтому, желательно использовать систему визуализации в условиях, ограниченных только фотонным шумом, сведя все остальные шумовые составляющие к относительно ничтожным значениям. В условиях низкой освещенности (предполагая темновой шум ничтожным благодаря охлаждению), шум чтения превышает фотонный шум; при этом сигнал изображения называется сигналом, ограниченным шумом чтения. Чтобы зарегистрировать больше фотонов и улучшить отношение С/Ш, можно увеличить время экспонирования (интегрирования) камеры, до той точки, когда фотонный шум превысит шум чтения и темновой шум. Сверх этого времени экспонирования изображение называется изображением, ограниченным фотонным шумом.

Ограниченное количество фотонов, имеющихся для формирования изображения, является критическим фактором для многих методов микроскопии. Поэтому, высококачественные камеры конструируются специально для достижения фотонно-ограниченного режима работы при значительно меньших уровнях сигнала, чем обычные камеры, которые, обычно, никогда не достигают этого режима (и достаточно высокого отношения сигнал/шум) при низких уровнях освещенности. В широкопольной микроскопии, где широко используются ПЗС-камеры, колебания амплитуды суммарного сигнала из фокального объема образца могут составлять несколько порядков, и зависеть, главным образом, от используемого метода визуализации и от самого образца. Поток величиной 10e6 (1 миллион) фотонов в секунду из фокального объема, т. е., предельно низкий уровень, эквивалентен распределению 1 фотон в секунду на пиксель по поверхности фотоприемника, имеющего 1 миллион активных пикселей. В качестве сравнения: минимальный предел обнаружения адаптированного к темноте глаза, приблизительно, в 40 раз выше (40 миллионов фотонов в секунду). Высококачественный флуоресцентный микроскоп обеспечивает, обычно, поток от 10e8 до 10e9 фотонов из фокального объема, или от 100 до 1000 фотонов в секунду на пиксель для того же 1-мегапиксельного фотоприемника. Обычный светлопольный режим визуализации обеспечивает, обычно, уровни освещенности (усредненные по всей площади фотоприемника) от 5000 до 40 000 фотонов на пиксель в секунду. Если интервал интегрирования не слишком короток, светлые области широкопольного изображения могут генерировать суммарный регистрируемый сигнал с уровнем более 100 000 фотонов на пиксель.

На рисунке 1 представлен график зависимости отношения сигнал/шум от времени интегрирования (экспонирования) типичной высококачественной ПЗС-камеры, предназначенной для получения изображений при низких уровнях сигнала. Фотонный поток и характеристики фотоприемника фиксированы и указаны на рисунке. На графиках такого типа можно выделить области ограничения сигнала шумом чтения и, соответственно, фотонным шумом. Границей раздела этих областей является время (интервал) экспонирования, начиная с которого фотонный шум превышает шум чтения (для указанных на рисунке параметров фотоприемника и светового потока — около 0,15 секунды). Поскольку фотонный шум и амплитуда сигнала связаны квадратичной зависимостью, граница раздела этих двух областей приходится на время экспонирования, для которого суммарный зарегистрированный сигнал на один пиксель равен, приблизительно, квадрату значения шума чтения. Например, при заданном среднеквадратичном значении шума чтения в 5 электронов на пиксель и существующем фотонном потоке, фотонный шум становится преобладающим при времени экспонирования, достаточном для регистрации более чем 25 фотонов на пиксель. В интерактивном обучающем приложении приводится график, аналогичный представленному на рисунке 1, результирующая кривая которого отражает изменения, вносимые при помощи регуляторов в каждую из регулируемых переменных. Помимо отображаемого слева вычисленного отношения сигнал/шум, в правом желтом окне отображается обновляемое значение Detected Photons/Pixel (Зарегистрированные фотоны/пиксель), а обновляющееся красное текстовое сообщение в верхней части графика указывает, какой шум — чтения или фотонный, является превалирующим для значений, определяемых положениями ползунковых регуляторов. Красная стрелка на кривой указывает текущее заданное время интегрирования. Переход между режимами с двумя разными типами превалирующего шума предполагает ничтожно малый темновой шум, что типично для научно-исследовательского класса ПЗС-систем формирования изображений, хотя возможны и иные ситуации. При определенных условиях, режимы с высокими уровнями темнового тока изменяют значимость относительных значений шума чтения и фотонного шума, в результате чего темновой шум может поглотить как сигнал, так и другие шумовые составляющие.

Рис. 2.  Улучшение отношения сигнала к шуму посредством бининга

В качестве еще одного механизма повышения отношения сигнал/шум в некоторых ПЗС-камерах научно-исследовательского класса реализована функция бининга пикселей. Следует понимать, что этот метод, в определенной степени, ухудшает пространственное разрешение и, попутно, увеличивает темновой ток. За счет улучшения отношения сигнал/шум матрицы ПЗС, при низких уровнях освещенности и/или при коротких временах экспонирования, система формирования изображений способна достичь режима сигнала, ограниченного фотонным шумом. Для повышения яркости изображения на высоких скоростях передачи кадров, некоторые камеры автоматически используют режим бининга пикселей в процессе предварительного просмотра изображения, что облегчает позиционирование образца и фокусировку. Для демонстрации влияния бининга на вычисленное отношение сигнал/шум, в обучающем приложении имеются селективные кнопки, соответствующие трем коэффициентам бининга. Текст на кнопках означает количество объединяемых функцией бининга пикселей, а именно: 1 пиксель — нет бининга; 4 пикселя — матрица из 2×2 пикселей объединяется в один «суперпиксель»; 16 пикселей — матрица из 4×4 пикселей объединяется в один «суперпиксель». Рисунок 2 иллюстрирует влияние различных значений бининга на поведение кривой зависимости отношения С/Ш от времени экспонирования. Использующееся в обучающем приложении и модифицированное с учетом бининга, уравнение для вычисления отношения С/Ш выглядит следующим образом: С/Ш = MPQet / [ MPQet + MDt + Nr2 ]½.

Символом M в этом модифицированном уравнении обозначено количество объединенных функцией бининга пикселей; предполагается, что сигналы всех этих пикселей одинаковы. Три кривые на рисунке построены для одного ПЗС-устройства с типовыми характеристиками, обозначенными на графике, и для очень низкой интенсивности сигнала от образца (в секунду на один пиксель фотоприемника падает поток из 40 фотонов). Отметим, что для достижения сигнала, ограниченного фотонным шумом, без использования бининга потребовалось бы экспонирование в течение, приблизительно, 4-х секунд. За счет 16-пиксельного бининга, эквивалентное отношение сигнал/шум и общее количество зарегистрированных фотонов на один пиксель достигается, приблизительно, за 0,25 секунды (см. рисунок 2). Это позволяет обновлять просматриваемое изображение с приемлемой скоростью передачи кадров, давая возможность выполнить фокусировку и позиционирование образца даже при низкой интенсивности (яркости) изображения.