Электронная микроскопия
Определение
Электронная микроскопия - совокупность электронно-зондовых методов исследования микроструктуры твердых тел, их локального состава и микрополей (электрических, магнитных и др.) с помощью электронных микроскопов - приборов, использующих электронный пучок для получения увеличенного изображения. Дополнительно, раздел электронной микроскопии включает в себя различные методы подготовки изучаемых объектов, обработки и анализа получаемой информации. Существует два основных направления электронной микроскопии: растровая (сканирующая) и трансмиссионная (просвечивающая). Данные направления базируются на использовании соответствующих типов электронных микроскопов.
Для подробного ознакомления с медицинской и исследовательской техникой основных мировых производителей оптических систем и сопутствующего оборудования посетите наш каталог или свяжитесь с нашими специалистами и получите полную профессиональную консультацию по любым, имеющимся у Вас, вопросам.
Основные понятия
Электронный луч - направленный пучок ускоренных электронов, который используется для просвечивания образцов или возбуждения в них вторичных излучений.
Ускоряющее напряжение - напряжение между электродами электронной пушки, определяющее кинетическую энергию электронного луча.
Разрешающая способность (разрешение) - наименьшее расстояние между двумя элементами микроструктуры, видимыми на изображении раздельно.
Светлопольное изображение - увеличенное изображение микроструктуры, сформированное электронами, прошедшими через объект с малыми энергетическими потерями [структура изображается на экране электроннолучевой трубки (ЭЛТ) темными линиями и пятнами на светлом фоне].
Темнопольное изображение формируется рассеянными электронами (основной пучок электронов при этом отклоняют или экранируют) и используется при изучении сильнорассеивающих объектов (напр., кристаллов); по сравнению со светлопольным выглядит как негативное.
Хроматическая аберрация - снижение скорости электронов после просвечивания объекта, приводящее к ухудшению разрешения; усиливается с увеличением толщины объекта и уменьшением ускоряющего напряжения.
Контрастирование (химическое и физическое) - обработка исследуемых образцов для повышения общего контраста изображения и(или) выявления отдельных элементов их структуры.
Оттенение - физическое контрастирование микрочастиц, макромолекул, вирусов, состоящее в том, что на образец в вакуумной установке напыляется тонкая пленка металла; при этом "тени" (ненапыленные участки) прорисовывают контуры частиц и позволяют измерять их высоту.
Негативное контрастирование - обработка микрочастиц или макромолекул на пленке-подложке р-рами соед. тяжелых металлов (U и др.), в результате чего частицы будут видны как светлые пятна на темном фоне (в отличие от позитивного контрастирования, делающего темными сами частицы).
Ультрамикротом (ультратом) - прибор для получения ультратонких (0,01-0,1 мкм) срезов объектов с помощью стеклянных или алмазных ножей.
Реплика - тонкая, прозрачная для электронов пленка из полимерного материала либо аморфного углерода, повторяющая микрорельеф массивного объекта или его скола.
Сканирование - последовательное облучение изучаемой поверхности узким электронным лучом - зондом с помощью развертки (в трансмиссионных приборах облучается сразу все поле зрения).
Развертка - периодическое отклонение электронного луча по осям X и Y с целью формирования электронного растра.
Растр - система линий сканирования на поверхности образца и на экране ЭЛТ.
Трансмиссионная микроскопия
Трансмиссионная микроскопия реализуется с помощью трансмиссионных (просвечивающих) электронных микроскопов (ТЭМ; рис. 1), в которых тонкопленочный объект просвечивается пучком ускоренных электронов с энергией 50-200 кэВ. Электроны, отклоненные атомами объекта на малые углы и прошедшие сквозь него с небольшими энергетическими потерями, попадают в систему магнитных линз, которые формируют на люминесцентном экране (и на фотопленке) светлопольное изображение внутренней структуры. При этом удается достичь разрешения порядка 0,1 нм, что соответствует увеличениям до 1,5 х 106 раз. Рассеянные электроны задерживаются диафрагмами, от диаметра которых в значительной степени зависит контраст изображения. При изучении сильнорассеивающих объектов более информативны темнопольные изображения.
Разрешение и информативность ТЭМ-изображений во многом определяются характеристиками объекта и способом его подготовки. При исследовании тонких пленок и срезов полимерных материалов и биологических тканей контраст возрастает пропорционально их толщине, но одновременно снижается разрешение. Поэтому применяют очень тонкие (не более 0,01 мкм) пленки и срезы, повышая их контраст обработкой соединениями тяжелых металлов (Os, U, Pb и др.), которые избирательно взаимодействуют с компонентами микроструктуры (химическое контрастирование). Ультратонкие срезы полимерных материалов (10-100 нм) получают с помощью ультрамикротомов, а пористые и волокнистые материалы предварительно пропитывают и заливают в эпоксидные компаунды. Металлы исследуют в виде получаемой химическим или ионным травлением ультратонкой фольги. Для изучения формы и размеров микрочастиц (микрокристаллы, аэрозоли, вирусы, макромолекулы) их наносят в виде суспензий либо аэрозолей на пленки-подложки из формвара (поливинилформаль) или аморфного С, проницаемые для электронного луча, и контрастируют методом оттенения или негативного контрастирования.
Рис. 1. Схема устройства трансмиссионного электронного микроскопа: 1 - электронная пушка; 2 - конденсор; 3 -образец; 4, 5- объектив и его диафрагма; 6, 7- промежуточная и проекционная линзы; 8 -смотровое окно; 9 - люминесцентный экран; 10 - фотокамера с затвором; 11 - вакуумная система.
Для анализа металлической фольги, а также толстых (1-3 мкм) срезов др. материалов используют высоко- и сверхвысоковольтные ТЭМ с ускоряющими напряжениями соотв. 200-300 и 1000-3000 кВ. Это позволяет снизить энергетические потери электронов при просвечивании образцов и получить четкие изображения, свободные от хроматической аберрации.
Структура гелей, суспензий, эмульсий и биологических тканей с большим содержанием воды может быть исследована методами криорепликации: образцы подвергают сверхбыстрому замораживанию и помещают в вакуумную установку, где производится раскалывание объекта и осаждение на поверхность свежего скола пленки аморфного С и оттеняющего металла. Полученная реплика, повторяющая микрорельеф поверхности скола, анализируется в ТЭМ. Разработаны также методы, позволяющие делать ультратонкие срезы замороженных объектов и переносить их, не размораживая, в ТЭМ на криостолик, сохраняющий температуру объекта в ходе наблюдения на уровне -150 °С (криоультратомия и криомикроскопия).
ТЭМ обеспечивает также получение дифракционных картин (электронограмм), позволяющих судить о кристаллической структуре объектов и точно измерять параметры кристаллических решеток. Всочетании с непосредственными наблюдениями кристаллических решеток в высокоразрешающих ТЭМ данный метод - одно из основных средств исследования ультратонкой структуры твердого тела.
Растровая (сканирующая) микроскопия
В растровых электронных микроскопах (РЭМ; рис. 2) электронный луч, сжатый магнитными линзами в тонкий (1-10 нм) зонд, сканирует поверхность образца, формируя на ней растр из нескольких тысяч параллельных линий. Возникающее при электронной бомбардировке поверхности вторичные излучения (вторичная эмиссия электронов, оже-электронная эмиссия и др.) регистрируются различными детекторами и преобразуются в видеосигналы, модулирующие электронный луч в ЭЛТ. Развертки лучей в колонне РЭМ и в ЭЛТ синхронны, поэтому на экране ЭЛТ появляется изображение, представляющее собой картину распределения интенсивности одного из вторичных излучений по сканируемой площади объекта. Увеличение РЭМ определяется как М = L/l, где L и l - длины линий сканирования на экране ЭЛТ и на поверхности образца.
Рис. 2. Схема устройства растрового электронного микроскопа: 1 - электронная пушка; 2 - конденсор; 3 - отклоняющая система; 4 - конечная линза с корректором астигматизма; 5 - объектный столик; 6 - образец; 7 - вакуумная система; 8 - генератор разверток; 9 - блок управления увеличением; 10 -селектор сигналов (для выбора регистрируемого вторичного излучения); 11 -видеоусилитель; 12,13 - ЭЛТ и ее отклоняющая система; BИ1-BИ3 - потоки вторичных излучений; C1 - C3 - электрич. сигналы; Д1-Д3 - детекторы; ЭЛ1, ЭЛ2 - электронные лучи; X, Y - направления сканирования (строчная и кадровая развертки).
Выбор регистрируемого вторичного излучения обусловлен задачей исследования. Основной режим работы РЭМ – регистрация вторичных электронов (ВЭ). Поскольку интенсивность эмиссии ВЭ сильно зависит от угла падения электронного луча на поверхность, получаемое изображение весьма близко к обычному макроскопическому изображению рельефа объекта, освещаемого со всех сторон рассеянным светом; иначе говоря, формируется топографический контраст. Эмиссия ВЭ отличается наибольшей интенсивностью по сравнению с другими вторичными излучениями. Кроме того, в этом режиме достигается макс. разрешение.
При исследовании неоднородных по составу поверхностей на топографическое изображение ВЭ накладывается дополнительное распределение яркостей, зависящее от среднего атомного номера Z вещества образца на каждом микроучастке (так называемый композиционный, или Z-контраст), который проявляется сильнее, если регистрировать не вторичные, а упругорассеянные электроны. Этот режим применяют при исследовании шлифов металлических сплавов минералов, композиционных материалов и других объектов, когда топографический контраст отсутствует и нужно установить композиционную неоднородность поверхности.
Тонкопленочные образцы (до 1 мкм) просвечиваются электронным лучом насквозь и прошедшие электроны регистрируются детектором, расположенным под объектом. Изображения, получаемые в этом режиме, иногда более информативны, чем обычные ТЭМ-изображения, т.к. свободны от хроматической аберрации.
В технических исследованиях используется также регистрация поглощенных электронов в сочетании с приложением рабочих напряжений к изучаемому транзистору или интегральной схеме. Это позволяет получать изображение, отвечающее распределению электрических потенциалов, и таким образом выявлять микродефекты в элементах схемы. При этом можно прерывать первичный электронный луч с высокой частотой и визуализировать прохождение по схеме высокочастотных сигналов.
С помощью соответствующих детекторных систем и спектрометров в РЭМ можно регистрировать электромагнитные излучения: катодолюминесценцию, тормозное и характеристические рентгеновские излучения, а также оже-электроны. Получаемые при этом изображения и спектры дают количеств, информацию о локальном элементном составе поверхностных слоев образца и широко применяются в материаловедении.
Для изучения структуры поверхности посредством РЭМ к образцу предъявляется ряд требований. Прежде всего, его поверхность должна быть электропроводящей, чтобы исключить помехи за счет накопления поверхностного заряда при сканировании. Кроме того, нужно всемерно повышать отношение сигнал/шум, которое наряду с параметрами оптической системы определяет разрешение. Поэтому перед исследованием на диэлектрические поверхности путем вакуумного испарения или ионного распыления наносят тонкую (15-20 нм) однородную пленку металла с высоким коэффициентом вторичной электронной эмиссии (Au, Au-Pd, Pt-Pd). Биологические объекты, содержащие, как правило, большое количество воды, перед нанесением покрытия необходимо зафиксировать специальной химической обработкой и высушить, сохранив естественный микрорельеф поверхности (сушка в критической точке с использованием сжиженных СО2 и N2O, хладонов или вакуумнокриогенными методами).
Разрешающая способность РЭМ определяется многими факторами, зависящими как от конструкции прибора, так и от природы исследуемого объекта. Если образец электро- и теплопроводен, однороден по составу и не обладает приповерхностной пористостью, в РЭМ с вольфрамовыми электродами достигается разрешение 5-7 нм, в РЭМ с электронными пушками на полевой эмиссии - 1,0-1,5 нм.
Перспективные направления развития
К ним относятся: повышение разрешающей способности ТЭМ и РЭМ; совершенствование способов подготовки образцов; разработка методов получения качественно новой информации и повышения чувствительности методов анализа с помощью спектрометрических систем; разработка методов компьютерной обработки полученных изображений с целью выявления содержащейся в них количественной информации о структуре объекта; автоматизация и компьютеризация ТЭМ, РЭМ и соединенной с ними аналитической аппаратуры.
Повышение разрешающей способности микроскопов достигается главным образом совершенствованием электронной оптики и применением новых видов электронных пушек. Замена традиционных вольфрамовых термокатодов на ориентир, катоды из LaB6 позволила повысить электронную яркость пушек в 5-7 раз, а переход к пушкам на полевой эмиссии (автоэмиссии) с холодными катодами из монокристаллического W - в 50-100 раз, что дало возможность уменьшить диаметр электронного зонда и довести разрешение РЭМ до 1 нм, существенно снизив при этом лучевую нагрузку на образец.
Развитие способов подготовки образцов наиболее активно происходит в области электронно-микроскопического исследования структуры полимерных материалов и влагосодержащих объектов и связано преимущественно с разработкой криогенных методов (сверхбыстрое замораживание в струе хладона, прижим к металлическому блоку, охлаждаемому жидким Не, низкотемпературное замещение воды органическими растворителями, криоультратомия, криомикроскопия и др.). Эти методы позволяют избежать нарушений структуры и локального состава образцов, наблюдаемых при химической фиксации и нанесении электропроводных покрытий.
Такая же цель достигается и при использовании низковакуумного растрового электронного микроскопа (НВРЭМ), дающего возможность исследовать поверхность сильно увлажненных и даже живых объектов без предварительной химической или криогенной фиксации. В НВРЭМ объектная камера отделена от колонны РЭМ диафрагмой малого диаметра, пропускающей сканирующий электронный луч, но препятствующей проходу молекул газов в высоковакуумную часть колонны. Испускаемые поверхностью ВЭ собираются специальным кольцевым детектором, охватывающим объект. Использование НВРЭМ значительно расширяет исследовательские возможности биологов, почвоведов и материаловедов, позволяя в перспективе создать "полевой" вариант РЭМ.
Мощный прорыв в трансмиссионной электронной микроскопии был сделан в 1980-х гг., когда удалось создать ТЭМ с компьютерным анализатором элементного состава на базе спектрометра энергетических потерь. Метод спектрометрии энергетических потерь электронов (EELS - Electron Energy Loss Spectrometry) был известен давно и применялся для микроанализа в трансмиссионно-сканирующем режиме ТЭМ. Однако установка спектрометрической системы из двух магнитных призм и электростатического зеркала между двумя промежуточными линзами (а не под экраном и фотокамерой, как обычно) дала возможность гибко регулировать контраст ТЭМ-изображения, получать безаберрационные изображения толстых (до 1 мкм) срезов, а главное, получить элементно-селективные изображения в диапазоне элементов от В до U с разрешением порядка 0,5 нм и чувствительностью обнаружения до 10-20 г элемента (что соответствует, например, 150 атомам Са). Такое сочетание характеристик создает большие преимущества электронной микроскопии перед традиционными методами рентгеноспектрального микроанализа при изучении срезов и пленок.
Развитие компьютерной техники обусловило значительный прогресс в области математической обработки электронных изображений (компьютерная морфометрия). Разработанные аппаратно-программные комплексы позволяют: запоминать изображения, корректировать их контраст; расширять диапазон яркостей путем введения условных цветов; устранять шумы; подчеркивать границы микроучастков, выделять детали микроструктуры в заданном диапазоне размеров и оптической плотности; проводить статистическую обработку изображений и строить гистограммы распределения микрочастиц по размерам, форме и ориентации; реконструировать объемные изображения структуры композиционных материалов и иных объектов по микрофотографиям серийных срезов; реконструировать объемные изображения микрорельефа и строить профилограммы сечений по стереомикрофотографиям; рассчитывать локальные микроконцентрации элементов по элементно-селективным изображениям и спектрам; определять параметры кристаллич. решеток по электронограммам и др. Кроме того, встроенные в ТЭМ и РЭМ процессоры позволяют гибко управлять микроскопами, значительно снижают электроннолучевое повреждение образцов, повышают достоверность и воспроизводимость результатов анализа микроструктуры, облегчают труд исследователей.
Метод реплик
Рассмотрим метод реплик для изучения поверхностной геометрической структуры массивных тел. С поверхности такого тела снимается отпечаток в виде тонкой плёнки углерода, коллодия, формвара и др., повторяющий рельеф поверхности и рассматривается в просвечивающем электронном микроскопе. Обычно предварительно под скользящим (малым к поверхности) углом на реплику в вакууме напыляется слой сильно рассеивающего электроны тяжёлого металла (например, Pt), оттеняющего выступы и впадины геометрического рельефа.
Метод декорирования
Метод декорирования исследует не только геометрическую структуру поверхностей, но и микрополя, обусловленные наличием дислокаций, скопления точечных дефектов, ступени роста кристаллических граней, доменную структуру и т. д. . Согласно этому методу на поверхность образца вначале напыляется очень тонкий слой декорирующих частиц (атомы Au, Pt и др., молекулы полупроводников или диэлектриков), осаждающихся преимущественно на участках сосредоточения микрополей, а затем снимается реплика с включениями декорирующих частиц.
Амплитудная электронная микроскопия
Методы амплитудной электронной микроскопии могут быть использованы для обработки изображений аморфных и других тел (размеры частиц которых меньше разрешаемого в электронном микроскопе расстояния), рассеивающих электроны диффузно. В просвечивающем электронном микроскопе, например, контраст изображения, т. е. перепад яркостей изображения соседних участков объекта, в первом приближении пропорционален перепаду толщин этих участков.
Фазовая электронная микроскопия
Для расчёта контраста изображений кристаллических тел, имеющих регулярные структуры (при рассеянии частиц на таких телах происходит дифракция частиц), а также для решения обратной задачи — расчёта структуры объекта по наблюдаемому изображению — применяются методы фазовой электронной микроскопии. Рассматривается задача о дифракции электронной волны на кристаллической решетке, при решении которой дополнительно учитываются неупругие взаимодействия электронов с объектом: рассеяние на плазмах, фононах и т. п. В просвечивающих электронных микроскопах и растровых просвечивающих электронных микроскопах высокого разрешения получают изображения отдельных молекул или атомов тяжелых элементов. Привлекая методы фазовой электронной микроскопии, можно восстанавливать по изображениям трехмерную структуру кристаллов и биологических макромолекул. Для решения подобных задач используют, в частности, методы голографии, а расчеты производят на ЭВМ.
Рассмотрим одну из разновидностей фазовой электронной микроскопии — интерференционную электронную микроскопию, которая является аналогом оптической интерферометрии. Электронный пучок расщепляется с помощью электронных призм, и в одном из плеч интерферометра устанавливается образец, изменяющий фазу проходящей сквозь него электронной волны. Этот метод позволяет измерить, например, внутренний электрический потенциал образца.
Лоренцова электронная микроскопия
Областью исследования лоренцовой электронной микроскопии, в которой изучают явления, обусловленные силой Лоренца, являются внутренние магнитные и электрические поля или внешние поля рассеяния, например, поля магнитных доменов в тонких пленках, сегнетоэлектрических доменов, поля головок для магнитной записи информации и т. п.
Количественная электронная микроскопия
Методы количественной электронной микроскопии — это точное измерение различных параметров образца или исследуемого процесса, например измерение локальных электрических потенциалов, магнитных полей, микрогеометрии поверхностного рельефа и т. д.
Иммуноэлектронная микроскопия
Иммуноэлектронная микроскопия(Immune electron microscopy) – это непосредственная визуализация взаимодействия антигена и антител с помощью электронной микроскопии. Иммуноэлектронная микроскопия впервые была предложена для вирусологических исследований Дж. Альмейда и А. Ватерсоном в 1969г.
Схема метода иммуноэлектронной микроскопии состоит в следующем:
1.Обследуемый материал, который проверяется на наличие искомого вируса, смешивается и инкубируется со стандартной иммунной сывороткой;
2.Комплекс вирус-антитело осаждается центрифугированием в подходящих для него режимах;
3.К ресуспендированному осадку добавляется контрастирующее вещество;
4.Полученный препарат исследуется под электронным микроскопом.
Если реакция положительна, выявляются характерные агрегаты, состоящие из вирусных частиц, соединенных между собой мостиками из антител. Порог чувствительности иммуноэлектронной микроскопии невысок: надежное выявление вируса осуществимо, когда его концентрация в исходном материале составляет 104— 106 частиц в мл. Преимущество метода заключается в возможности оценивать не только исход серологической реакции, но и идентифицировать ее морфологический субстрат, т. е. определить форму и размер вирусных частиц. При наличии препаратов вируса с известным содержанием частиц иммуноэлектронная микроскопия может применяться и для количественного определения антител в сыворотках. Для этого предлагается применять специальную систему учета интенсивности взаимодействия вируса и антител.
На начальных этапах работы с вирусными гепатитами иммуноэлектронная микроскопия широко применялась в исследованиях и диагностике. С использованием иммуноэлектронной микроскопии, в частности, были идентифицированы вирус гепатита А и вирус гепатита Е. На сегодняшний день существуют более практичные тесты для массовых исследований клинических материалов. Поэтому диагностика гепатитов с помощью иммуноэлектронной микроскопии постепенно утратила свое значение, но ее по-прежнему успешно используют для характеристики морфологически отличных от вируса антигенов или каких-либо ранее неизвестных вирусных агентов.