|
|
|
|
Принцип работы
Флуоресцентный микроскоп - оптический прибор, показывающий в увеличенном виде клетки, поверхности и частицы с флуоресцирующими красителями. Схематично механизм флуоресценции выглядит так: При облучении флуоресцирующего вещества (ФВ) светом с определенной длиной волны (частотой) электроны ФВ поглощают квант света, приобретают дополнительную энергию и переходят на более высокую орбиту. Электроны не могут долго оставаться в возбужденном состоянии на более высокой орбите и возвращаются на ранее занимаемую. При этом излишек энергии выпускается также в виде кванта света, но с меньшей энергией (частотой) или, соответственно, большей длиной волны. Часть энергии тратится на так называемую релаксацию. Разность длин волн возбуждающего и испускаемого света является основополагающим принципом наблюдений в флуоресцентной микроскопии.
Детектирование флуоресценции широко применяется в разных областях науки и является одним из самых чувствительных методов неразрушающего контроля. С помощью флуоресценции можно определить содержание всего одной молекулы связанной с флуорофором. Если в образце несколько флуорофоров, то для их детектирования используют узкополосные (с разным диапазоном волн), либо широкополосные блок-фильтры. При всех своих возможностях, флуоресцентный метод имеет и ограничения, так, например, не всегда можно подобрать фильтры так, чтобы исследовать отдельные флуорофоры (флуорохромы) в образце, если диапазоны длин волн их возбуждения пересекаются.
Подбирая фильтры для своих исследований, обратите внимание на флуоресцентный краситель. Для удобства подбора фильтров предлагаем ознакомиться со следующими таблицами:
В качестве источника света флуоресцентных (люминесцентных) микроскопов используются лампы - ртутные, металлогалидные, галогенные, светодиодные, а также лазеры.
Ртутные лампы – наиболее распространённые осветители для флуоресцентной микроскопии на данный момент, но они могут быть запрещены к закупке через государственные торги РФ с 2018 года. Эти лампы не могут обеспечить равномерную интенсивность в УФ и видимом диапазоне волн, их свечение наиболее интенсивно при длинах волн в 313, 334, 365, 406, 435, 546 и 578нм. Из-за такой пиковой интенсивности они часто используются для УФ возбуждения. У них существуют и проблемы с безопасностью, поэтому не рекомендуется их использование дольше срока годности, иначе они могут взорваться и повредить коллекторную линзу.
У галогенных ламп схожие с ртутными лампами проблемы, но вдвое-вчетверо больший ресурс. Тем не менее, из-за низкой интенсивности и отсутствия УФ части спектра они не так широко распространены как ртутные лампы.
Светодиодные лампы стали применять сравнительно недавно для флуоресцентной микроскопии. Они не требуют юстировки, полностью безопасны, имеют более равномерное распределение интенсивности, чем газоразрядные (ртутные, галогенные). Еще один плюс таких ламп: установив линзы Fly-eye, всё поле зрения будет равномерно освещено.
Лазеры испускают интенсивный когерентный световой пучок, имеющий малую расходимость. Благодаря когерентности пучка света разрешающая способность системы выше. Поэтому их используют для конфокальной микроскопии сверхвысокого разрешения.
Заключительный этап конфигурирования флуоресцентного микроскопа – это выбор фотокамеры. Для флуоресценции важно подобрать камеру с высоким динамическим диапазоном (чувствительностью), большим временем экспозиции, малым количеством шумов и большим размером пикселя, потому что каждая линза в оптическом пути микроскопа поглощает часть света, и на матрицу камеры попадает мало света. Да и само флуоресцентное свечение неравномерно. Наш мозг выполняет роль выдержки в камере и собирает усредненную картину флуоресценции, а камере необходимо время, чтобы на матрицу попало достаточно количество света от образца.
Камеры с пзс (ccd) матрицами и активным охлаждением предпочтительнее для слабой флуоресценции, потому что их матрицы чувствительнее кмоп (cmos) и меньше подвержены цифровым шумам.
Да, быстродействие (количество кадров в секунду) CCD камеры будет немного ниже, чем у CMOS, но для флуоресценции это не имеет решающего значения.
Современное программное обеспечение камер состоит из различных модулей. Для флуоресценции наиболее полезными окажутся модули сшивки изображения, подсчёта численности объектов, FRAP и FRET анализ (совмещение и наложение) флуоресцентных снимков. Все эти модули есть в программном обеспечении CellSens и BZ analyser.
Поскольку в конфокальной микроскопии тоже используют флуоресценцию, то уточним, что всё вышесказанное относится именно к эпифлуоресценции. Приведем краткий исторический очерк:
Первый эпифлуоресцентный микроскоп, в котором была решена проблема разделения возбуждающего света и флуоресцентного сигнала был сконструирован в 1929 году.
Этот микроскоп отличался от предыдущих щелевых флуоресцентных микроскопов тем, что детекция флуоресцентного сигнала осуществлялась только со стороны образца, поэтому наблюдатель видел только эмиссию света от флуорофора. С течением времени расширилась область применения таких микроскопов,например, флуоресцентные микроскопы стали использовать в материаловедении, для выявления дефектов поверхности, содержания полимеров в битуме, анализа краски и других. Возросшее разрешение флуоресцентных микроскопов позволяет вести более точную детекцию сигнала и получать более информативные изображения.Снимки стали информативнее, благодаря наложению изображений, снятых с использованием разных фильтров.
Микроскопия зародилась в Германии, и самые известные производители микроскопов Европы имеют немецкие корни. Однако,с конца двадцатого века, японские производители стали активно и на равных конкурировать с классической немецкой школой микроскопостроения.
Среди микроскопов классической немецкой школы особенно выделяются: Hund H600 FL, оснащённый слайдером с пятью блоками фильтров и ртутной лампой, а также Hund Wilovert AFL – инвертированный микроскоп с 100Вт ртутной лампой.
Японские производители микроскопов: корпорация Olympus – выпустившая первый серийный микроскоп в Азии, входящая в рейтинг лучших производителей оптики и компания Keyence – выпускающая роботизированные микроскопы для высокотехнологичных и точных производств.
Модели Olympus для флуоресценции:
- Лабораторный флуоресцентный микроскоп CX43 со светодиодным (LED) флуоресцентным модулем (с одним блоком фильтров).
- Исследовательские флуоресцентные микроскопы BX43, BX53 и BX63 оснащаются флуоресцентным светодиодным/ртутным или ксеноновым осветителем с турелью для восьми(маленьких) и шести (больших).блоков-фильтров.
- Инвертированный лабораторный флуоресцентный микроскоп CKX53 – комплектуется флуоресцентным модулем на 2 блока фильтров.
- Инвертированные исследовательские микроскопы IX73 и IX83 – оснащаются флуоресцентным модулем на 6 блок-фильтров. IX83 – может быть переоборудован в конфокальную систему.
- Флуоресцентные микроскопы на основе стереомикроскопов SZX10 и SZX16.
