C связи со спецификой темы ряд терминов, возможно, еще не имеет устоявшихся аналогов и/или точных переводов на русский язык. Предлагаемые здесь термины и словосочетания могут быть спорными с точки зрения специалистов, имеющих опыт в той или иной сфере (выделены синим цветом), и не претендуют на истину в последней инстанции.
Кроме того, позиция экспертов, принимавших участие в подготовке данного материала, состоит в том, что англоязычные аббревиатуры имеет смысл использовать “as is”, без прямого перевода на русский язык. Также ряд терминов могут использоваться в виде кальки с английского языка, пока не будут предложены удачные варианты перевода или в русском языке не появятся подходящие термины.
В целом текст делает попытку обобщить информацию, встречающуюся в различных источниках и тем самым облегчить работу российских специалистов в данной области знаний (перев.).
Поглощение (Оптическая плотность) - Absorbance (Optical Density) – доля световой энергии, поглощенной химическим или биологическим веществом, измеренная спектрофотометром или аналогичным устройством. Единица поглощения эквивалентна логарифму пропускания (отношение интенсивности пропущенного светового потока к интенсивности падающего светового потока). Полосы поглощения, как правило, занимают широкий диапазон длин волн (десятки и сотни нанометров) и чаще всего изображаются в виде функции интенсивности света, пропускания или оптической плотности от длины волны.
Акусто-оптический перестраиваемый фильтр (AOTF) - Acousto-Optic Tunable Filter (AOTF) – Фильтрующее устройство, использующее звуковые колебания для модулирования длины волны или интенсивности света, испускаемого лазером или некогерентным источником света (в первую очередь дуговыми лампами). Фильтр состоит из специализированного кристалла (оксид теллура или кварц), зажатого с двух сторон акустическими излучателем и поглотителем для наведения в кристалле стоячих акустических волн с переменными зонами высокого и низкого преломления. Если поляризованный или неполяризованный свет проходит через фильтр, кристалл воздействует на него как дифракционная решетка, отклоняющая проходящий луч. Для изменения периода дифракционной решетки выбираются характерные длины стоячих волн, получаемые в результате изменения звуковых колебаний, подводимых к кристаллу.
Акридиновый оранжевый (краситель) - Acridine Orange – Азотный гетероциклический хромофор, содержащий ядра акридина, связывающийся с ДНК и РНК путем включения между последовательными парами нуклеотидов и дающий сильную, но широкую полосу излучения от зеленого до красного диапазона длин волн. Акридиновый оранжевый возбуждается зелено-голубой полосой лазера (488 нм) или дуговой лампой (ртутной или ксеноновой) в сочетании с ультрафиолетовым, фиолетовым или синим интерференционными фильтрами. Отлично подходит для проявления многих клеточных структур, но не годится для использования в сочетании с другими красителями, так как имеет широкий спектр излучения.
Флуоресцентные красители Alexa - Alexa Fluor Dyes – Группа родственных синтетических флуоресцентных красителей – торговая марка компании Molecular Probes – используемых для маркировки антител, нуклеиновых кислот и для проведения общих исследований белков, цитоскелетных элементов, липидов, а также в нейробиологии в целом. Спектры возбуждения и испускания для красителей Alexa Fluor захватывают диапазон от дальнего ультрафиолета через всю видимую область до ближних инфракрасных частот. В целом красителям Alexa Fluor характерны высокая стабильность и сопротивляемость выцветанию.
Уровень ослабления (гашения) - Attenuation (Blocking) Level – ослабление или гашение видимого или ультрафиолетового светового сигнала до его поступления в оптическую систему, например, в флуоресцентный микроскоп. Степень ослабления обычно выражается для конкретной длины волны или диапазона длин как функция относительной интенсивности или абсолютной оптической плотности. Ослабление, также называемое модуляцией или гашением интенсивности света, может производиться нейтральными фильтрами плотности или, в конфокальной микроскопии, акусто-оптическими перестраиваемыми фильтрами (AOTF).
Автофлуоресценция (собственная флуоресценция) - Autofluorescence (Primary Fluorescence) – Образование фоновой флуоресценции эндогенными метаболитами и органическими или неорганическими флуоресцентными составляющими, присутствующими в биологических образцах и иных материалах. В некоторых случаях автофлуоресценция достаточно сильна для того, чтобы ее можно было ошибочно принять за флуоресценцию меченых молекул. Как правило источниками автофлуоресценции в биологических клетках и тканях являются флавины, флавиновые белки и нуклеотиды (FAD и FMN), витамины группы B, редуцированные пиридиновые нуклеотиды, (NADH и NADPH), жирные кислоты, цитохромы, порфирины, липофуксиновые пигменты, серотонин и катехоламины. Автофлуоресценция в растительных клетках имеет место главным образом в хлорофилле (красная флуоресценция) и лигнине (зеленая флуоресценция). В целом автофлуоресценция имеет наивысший уровень при изучении живых клеток под воздействием синих или ультрафиолетовых волн возбуждения.
Автоматизированная флуоресцентная графическая цитометрия - Automated Fluorescence Image Cytometry (AFIC) – Применение флуоресцентных зондов совместно с компьютеризованными микроскопическими системами (флуоресцентный микроскоп отраженного света, высокочувствительная камера и компьютер) для обеспечения высокоскоростного автоматического просмотра окрашенных образцов с надежным и точным определением практически всех клеток. Маркеры заболеваний могут выявляться этим способом при помощи специфических чувствительных флуорохромов, прикрепленных к антителам или нуклеиновым кислотам. При помощи выборочного возбуждения нужных флуорофоров получаются изображения с высоким отношением сигнал/шум, что в свою очередь повышает качество полученного изображения.
Среднее пропускание - Average Transmission – В номенклатуре фильтров под средним пропусканием понимается средний уровень интенсивности света, пропущенного в определенной области (полезной полосе пропускания) по отношению к полному спектру. В стандартном полосовом фильтре средняя область пропускания занимает всю ширину полосы пропускания при половинной высоте. В широкополосном и узкополосном фильтрах этим термином обозначают область пропущенных длин волн, находящуюся соответственно между нижней и верхней частотами среза.
Фон - Background – Различимый свет (световой шум), не являющийся частью сигнала, испускаемого флуоресцентным зондом. Источниками фонового шума могут быть перекрестные помехи в фильтрах возбуждающего и испускаемого излучения, утечки света в микродиафрагме, артефакты в фильтрах возбуждающего и испускаемого излучения, утечки флуорохромов в заливочной среде, неспецифичное окрашивание флуорохромов, электронный шум в цифровых фотокамерах, а также автофлуоресценция. В идеальном случае шумовой фон в флуоресцентной микроскопии должен быть доведен до максимально черного (цвета сажи) для увеличения уровня контраста изображения образца.
Полосовой фильтр - Bandpass Filter – фильтр, пропускающий определенный диапазон (полосу) длин волн ослабляя при этом волны большей и меньшей длины, чем у пропускаемых. Длина волны в середине пропускаемой полосы обычно называется средней (CWL). Эффективная полоса пропускания измеряется шириной зоны, пропускающей половину от максимума падающего света, которая еще называется полосой половинного пропускания (аббревиатуры FWHM и HBW). В флуоресцентной микроскопии полосовые фильтры чаще используются в тракте возбуждения и реже в качестве пороговых (барьерных) фильтров.
Барьерные фильтры (испускания) - Barrier (Emission) Filter – Оптические фильтры, как правило, пропускающие длинноволновую область или имеющие четко выраженную полосу пропускания, которые пропускают флуоресцентное излучение от образца, отсекая при этом остаточное излучение возбуждения. Барьерные фильтры часто изготавливаются с использованием цветных стекол или множественных интерференционных полостей и, для получения оптимальных результатов, применяются в комплекте с фильтрами возбуждения и дихроичными зеркалами.
Светоделитель - Beamsplitter – Оптическое устройство, используемое для разделения падающего светового луча на две или более составляющих, каждые из которых проецируются в различных направлениях. Для выполнения каких-либо определенных условий светоделители бывают различных конфигураций. В окулярных блоках оптических микроскопов используются призматические светоделители для одновременного проецирования изображения в окуляры и фотокамеру (цифровую камеру). Для получения линейно поляризованного света применяются поляризующие светоделители из природного кварца - материала с двойным преломлением. В флуоресцентной микроскопии для отражение волн возбуждения обратно к источнику и пропускания более длинноволнового вторичного флуоресцентного излучения к окулярам и детектору в качестве светоделителей используются дихроматичные (дихроичные) зеркала.
Биолюминесценция - Bioluminescence – Биохимический окислительный процесс, в результате которого выделяется энергия в виде света. В качестве характерного примера биолюминесценции обычно приводится люминесценция светлячков, при которой необходимо наличие энзима люциферазы для катализа реакции между люциферином в качестве субстрата и молекулярным кислородом (в присутствии аденозинтрифосфата). Это явление часто наблюдается у морских организмов и насекомых.
Проступание (перепуск) - Bleed-Through (Crossover) – Проступание или перепуск проявляется, когда нехарактерные длины волн проходят сквозь фильтр, предназначенный для их задержания. Эффект обычно проявляется, когда конструкция фильтра не позволяет до конца погасить путем интерференции длины волн вне диапазона пропускания. Эта же проблема имеет место, когда свет падает под значительным углом к поверхности фильтра, или когда спектры возбуждения и испускания флуоресцентных красителей перекрываются.
Блокированные флуорофоры - Caged Fluorophores – Блокированные флуорофоры обычно имеют ковалентную связь со связующей субстанцией (как правило, органической стуктурой), но могут быть фотолитически высвобождены (разблокированы) импульсом света. Характерные флуорохромы переводятся в блокированное состояние при посредстве производных нитробензола, которые фиксируют флуоресцентные продукты в нефлуоресцентной таутомерной форме. Можно получить и использовать для экспериментов большое количество разнообразных блокированных молекул.
Хромофор - Chromophore – Натуральный или синтетический краситель с характерным оптическим поглощением, обычно содержащий комбинацию чередующихся одиночных и парных связей или же высокую степень циклических ароматических или гетероциклических связей. В оптической микроскопии к хромофорам относят классические красители, такие как эозин, сафранин или гематоксилин, применяемые для окрашивания тканей, наблюдаемых при высокой освещенности. Флуоресцентные зонды тоже классифицируют как хромофоры, потому что они демонстрируют сильные спектры поглощения в ультрафиолетовой, видимой и ближней инфракрасной областях.
Микроскопия на когерентном антистоксовом комбинационном рассеянии света (CARS) - Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopy – Основное преимущество микроскопии CARS состоит в том, что она позволяет исследовать биологические молекулы без добавления синтетических флуоресцентных меток или эндогенного привязывания к флуоресцентным белкам. Вместо этого метод основан на использовании колебательных свойств изучаемых молекул и не требует возбуждения образца ультрафиолетовым или видимы светом. На практике быстрые лазерные импульсы (пикосекунды или менее) от двух источников в ближней инфракрасной области фокусируются на образце, а изображение в объективе получается сканированием в поперечном и осевом направлениях. Импульсы разделены по частоте путем выбора колебательного режима молекулы и генерируют в фокальной плоскости объектива новый луч с длиной волны меньшей, чем у падающих лучей. Вторичный луч создает профиль распределения концентрации изучаемого образца и позволяет построить его трехмерное изображение.
Когерентный свет - Coherent Light – Луч света, характеризуемых одинаковой фазой колебаний отдельных волн, не обязательно колеблющихся в одной плоскости. Для сохранения синфазности на дальних расстояниях когерентный свет должен быть монохроматическим (иметь одну и ту же длину волны). Например, луч лазера высоко когерентен, почти монохроматичен и как правило линейно поляризован.
Холодное зеркало - Cold Mirror – Специализированный дихроматичный интерференционный фильтр, который в очень широком диапазоне температур отражает весь видимый спектр, но очень эффективно пропускает волны в инфракрасной области. Аналогично горячим зеркалам холодные могут быть разработаны для отражения лучей, падающих под углами от нуля до 45 градусов и представлять собой многослойные диэлектрические покрытия наподобие интерференционных фильтров. Холодные зеркала могут использоваться в качестве дихроматических светоделителей в лазерных системах для отражения видимого света и пропускания инфракрасного.
Коллектор - Collector Lens – У широкопольных флуоресцентных микроскопов коллектор расположен между дуговой лампой и осветителем. Современные осветители имеют регулировочную рукоятку, позволяющую перемещать коллектор для фокусировки на плазменный шар лампы. Коллектор собирает свет с большой площади и направляет его в тыльную часть осветителя для последующей передачи на образец. Когда флуоресцентный микроскоп отъюстирован для освещения по Кёлеру коллектор используется для фокусировки увеличенного изображения плазменной дуги на фронтальную апертуру конденсора (объектива).
Цветные стеклянные фильтры - Colored Glass Filters – Стеклянные фильтры с содержанием коллоида или растворенного металла, созданные для поглощения определенных длин волн при свободной передаче остальных. Одно время в флуоресцентной микроскопии цветные стеклянные фильтры широко применялись для фильтров возбуждения или наборов пороговых фильтров, а также в качестве эффективных барьеров для ультрафиолетового и инфракрасного света.
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия - Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) – Популярная разновидность оптической микроскопии, в которой сфокусированный лазерный луч сканирует изучаемую область по осям Х и У, формируя таким образом растр изображения. Флуоресцентное излучение (отраженный свет) улавливается фотоэлектрическим умножителем (ФЭУ) и демонстрируется на экране монитора в виде растра. Размеры изображения на мониторе определяются разрешающей способностью электроники и размерами сканируемого растра. Свет, излучаемый участками вне фокальной плоскости, блокируется апертурой микродиафрагмы, расположенной конфокально с образцом. Эта методика позволяет выполнять тонкие оптические сечения образца вдоль оси Z.
Составное изображение (проекция в ракурсе) - Composite View (Projection View) – синтетическое трехмерное изображение, создаваемое путем наложения последовательных оптических сечений, полученных конфокальным или мультифотонным флуоресцентным микроскопом вдоль оптической оси Z образца (методика может применяться также и для дифференционно-контрастной оптики). В традиционной широкопольной флуоресцентной микроскопии изображение может быть расплывчатым из-за излучения, возникающего вне фокальной плоскости. Те же самые изображения, полученные конфокальными микроскопами, отличаются высокой четкостью.
Перекрестные помехи - Crosstalk – в терминологии фильтров характеризует минимальный уровень ослабления вне определенного диапазона для двух последовательно установленных фильтров. Степень перекрестных помех должна приниматься в расчет при подборе фильтров возбуждения и испускания в составе комбинированных флуоресцентных фильтров. Для оценки перекрестных помех в комбинированных флуоресцентных фильтрах часто используются дихроичные зеркала. Снижение или устранение перекрестных помех позволяет получать изображения, не испорченные флуоресцентным излучением флуорофоров от образцов, окрашенных несколькими красителями, когда спектр излучения выходит далеко за пределы диапазона комбинированного фильтра.
Цианиновые красители (цианиновые флуорохромы) - Cyanine Dyes (Cyanine Fluorochromes) – цианиновые красители, содержащие центрированную гетероциклическую бензоксазоловую группу, - флуоресцентные зонды, впервые выведенные на рынок компанией Amersham Inc.; известны своей высокой светоустойчивостью, хорошей растворимостью в воде и относительно высоким квантовым выходом. Цианиновые красители находят разнообразное применение в качестве флуоресцентных маркеров для белков, нуклеиновых кислот и суб-клеточных компонентов. На молекулярном уровне флуорохромы могут быть существенно модифицированы, чтобы их производные имели широкий спектр возбуждения и испускания, а также могут приобретать значительно измененную структуру для контроля растворимости, неспецифических взаимодействий (снижение фонового шума) и заданной химической активности.
Деконволюционная флуоресцентная микроскопия - Deconvolution Fluorescence Microscopy – Деконволюционный анализ - метод, применяющий алгоритмы обратной свертки к последовательности изображений, полученных вдоль оптической оси Z, усиливающие уровень сигнала, характерного для данной плоскости изображения или множественных фокальных плоскостей в последовательности изображений. Микроскоп должен быть оборудован прецизионным Z-приводом с шаговым двигателем для получения изображений через гарантировано равные промежутки фокальных плоскостей в образце. Типичным применением деконволюционного анализа является восстановление резкости и устранение света от источников вне конкретной изучаемой фокальной плоскости с использованием излучения возбуждения и флуоресцентной эмиссии (впрочем метод применим и для других способов освещения). В самых сложных случаях деконволюционный анализ применяется к последовательности изображений для получения проекций в ракурсе или трехмерных моделей.
Обратное сканирование - Descanning – Процесс в конфокальной микроскопии, в ходе которого свет, испускаемый образцом, собирается объективом и возвращается через сканирующие зеркала в дихроматичное зеркало. Когда сканирующий механизм настроен правильно, флуоресцентное пятно изображения падает точно на микродиафрагму детектора и не колеблется.
Дихроматичный светоделитель (дихроичное зеркало) - Dichromatic Beamsplitter (Dichroic Mirror) – Комбинация интерференционных фильтров/зеркал обычно применяемая в наборах фильтров для флуоресцентной микроскопии для получения четко определяемого перехода между пропускаемыми и отраженными длинами волн. Дихроматичное зеркало, наклоненное под углом 450 к падающему свету и испускаемому излучению, отражает коротковолновое излучение возбуждения под углом 900 на образец и пропускает более длинноволновое излучение от образца на окуляры и детектор. Дихроматичные зеркала для флуоресцентной микроскопии, изготовленные с использованием тонких интерференционных пленок способны отразить до 90 % возбуждающего излучения, одновременно пропуская до 90 % полосы флуоресцентного излучения. Дихроматичные зеркала обычно являются центральным (основным) элементом в трех видах фильтров (возбуждения, барьерных и дихроматичных зеркал), находящихся в составе блока флуоресцентных оптических фильтров.
Время выдержки - Dwell Time – В конфокальной микроскопии термин, обозначающий промежуток времени, в течение которого сканирующий лазерный луч находится на участке, соответствующем одной точке (пикселу) изображения. Как правило, экспозиция варьируется от 0,1 до 1 микросекунды или более, но ее рост до значительных величин увеличивает степень выцветания и уменьшает живучесть исследуемых клеток.
Электронное состояние - Electronic State – Общая конфигурация электронов в атоме или молекуле, которая в свою очередь определяет распределение отрицательного заряда (электронов) в молекуле и молекулярную геометрию. Каждая конкретная молекула может существовать в нескольких электронных состояниях (спокойном или нескольких возбужденных) в зависимости от общей энергии электронов и симметрии электронных спинов на орбитах. При комнатных температурах большинство молекул существует в электронном состоянии, соответствующем минимальной энергии (спокойное состояние). Когда молекула поглощает фотон, ее электроны переходят на более высокие энергетические уровни (в возбужденное состояние).
Спектр испускания (излучения) - Emission Spectrum – Полоса (спектр) длин волн, излучаемых атомом или молекулой (флуорохрома) после перехода в возбужденное состояние под воздействием фотона света или иного источника излучения. После того, как флуорохром испустил фотон, он возвращается в спокойное состояние и готов к новому циклу возбуждения и излучения. Как правило, спектр флуоресцентного излучения, который изображается в виде относительной функции от длины волны, располагается в зоне больших длин волн, чем спектр возбуждающего излучения (в действительности средняя длина испускаемой волны больше длины волны возбуждения). Кроме того, диапазон длин волн и профиль интенсивности спектра флуоресцентного излучения в целом не зависит от длины волны возбуждения.
Верхнее освещение (отраженный свет) - Epi-Illumination (Reflected Light) – Вид освещения в флуоресцентной микроскопии и микроскопии отраженного света. В конфигурации для отраженного света источник освещения (зачастую называемый верхним осветителем) располагается с той же стороны от образца, что и объектив, который в данном случае работает еще и как конденсор. В флуоресцентном микроскопе дихроматичное зеркало располагается на пути светового луча для отражения возбуждающего излучения от лампы в направлении образца и пропускания испускаемого излучения на окуляры и/или детектор.
Фильтр возбуждения - Excitation (Exciter) Filter – Первый элемент в составе согласованного набора фильтров (фильтр-кубика) в оптическом тракте флуоресцентного микроскопа. Фильтр возбуждения, наряду с остальными компонентами набора фильтров обычно устанавливается в верхнем осветителе и отфильтровывает необходимый диапазон излучения из широкого спектра источника освещения (например ртутной или ксеноновой разрядной лампы) для формирования полосы возбуждения в флуоресцентной микроскопии. Фильтры возбуждения часто изготавливаются в виде селективных полосовых фильтров с использованием интерференционного метода, но могут быть также составлены из цветных (окрашенных) стекол.
Спектр возбуждения - Excitation Spectrum – Спектр длин волн, обычно от ультрафиолетового до видимого света, способный возбуждать флуорохромы (атомы или молекулы) и вызывать флуоресценцию. Спектры возбуждения определяются путем сканирования спектра поглощения флуорохрома или флуорофора при одновременном наблюдении характерной длины волны (пикового значения) излучения. Так же как и для спектра поглощения, спектр возбуждения может расширяться из-за вибрационной или вращательной релаксации возбужденных молекул (внутренний переход). Спектры поглощения и возбуждения различны, но могут перекрываться иногда до почти полной неразличимости.
Скат фильтра - Filter Slope – Скат оптического фильтра – это характеристика профиля фильтра в области перехода от запирания к пропусканию. В целом, скат фильтра характеризуется длиной волны, на которой фильтр демонстрирует определенный коэффициент пропускания и крутизной характеристики в этом месте. Два различных фильтра могут иметь одни и те же частоты среза, но совершенно разные уровни запирания и скаты. Фильтры с очень крутыми скатами имеют узкую полосу пропускания, в то время как пологие скаты означают широкую полосу.
Флуоресценция - Fluorescence – Процесс, в ходе которого соответствующий атом или молекула, перешедшие на определенный уровень возбужденного состояния после поглощения энергии извне (обычно в видимом или ультрафиолетовом диапазоне) испускают поглощенную энергию в виде фотона с большей длиной волны, чем у поглощенного. В флуоресценции электрон, перешедший в синглетное состояние на возбужденной орбитали образует пару (или противоположный спин) с другим электроном на орбитали покоя. В результате возврат электрона в спокойное состояние является спин-разрешенным и происходит быстро с испусканием фотона. Процессы флуоресцентного возбуждения и излучения обычно длятся менее наносекунды.
Флуоресцентная анизотропия - Fluorescence Anisotropy – Термин означает фотоселективное возбуждение флуорофоров в связи с временным согласованием абсорбционного дипольного момента с электрическим вектором падающих фотонов. Аналогично возбуждению флуоресцентное излучение возбужденных флуорофоров происходит в плоскости параллельной дипольному моменту излучения. Переходные (дипольные) моменты возбуждения и испускания имеют определенную ориентацию по отношению к молекулярным осям молекул красителя и повернуты на определенный угол относительно друг друга. В возбужденном состоянии вращение флуорофора деполяризует его излучение по отношению к вектору возбуждения, таким образом проявляется механизм, позволяющий измерить структурную жесткость (вязкость) среды, содержащей флуорофор. Флуоресцентная анизотропия определяется как отношение разности интенсивности излучения параллельного электрическому вектору возбуждающего света и интенсивности перпендикулярной вектору к полной интенсивности.
Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (ФКС) - Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) – Применяемый главным образом совместно с лазерной сканирующей конфокальной или мультифотонной микроскопией, методика флуоресцентной корреляционной спектроскопии был разработан для определения молекулярной динамики для объемов, содержащих одну или несколько молекул и получения информации о скоростях химических реакций, коэффициентах диффузии, молекулярных массах, потоках и скоплениях в наблюдаемой области. В рамках ФКС малый объем (около одного фемтолитра) облучается сфокусированным лазерным лучом для регистрации спонтанных флуктуаций интенсивности флуоресценции, проявляющейся на уровне квантового выхода молекул, расположенных внутри этого объема, как функции времени. Относительно небольшие флуорофоры быстро диффундируют по освещенному объему и генерируют короткие случайные всплески интенсивности. В противоположность этому более сложные конструкции (флуорофоры, связанные с макромолекулами) движутся медленнее и дают более протяженные и стабильные во времени картинки распределения интенсивности флуоресценции.
Комбинация флуоресцентной микроскопии и метода ДИК - Fluorescence and DIC Combination Microscopy – Сочетание двух наиболее эффективных методик усиления контраста в оптической микроскопии - флуоресценции и дифференциального интерференционного контраста (ДИК) может использоваться для получения изображений с большим количеством деталей живых клеток с одновременным наблюдением распределения добавленных флуорофоров. В связи с тем, что методика ДИК требует применения сложных сочетаний поляризаторов и двоякопреломляющих светоделителей (призмы Номарски или Уолластона), использующих проходящий свет, изображение изучаемого поля зрения должно захватываться отдельно от флуоресцентной картинки, полученной в отраженном свете. Оба изображения затем накладываются друг на друга для получения пространственного распределения интенсивности флуоресценции в структуре клетки. В отдельных случаях дихроматичное зеркало флуоресцентного микроскопа может использоваться в качестве поляризатора (анализатора) для одновременного получения изображений обоими способами.
Набор флуоресцентных фильтров - Fluorescence Filter Set – Обычно размещаемые в оптических блоках кубической формы, наборы флуоресцентных фильтров состоят из фильтров возбуждения и испускания в комплекте с дихроматичным зеркалом. Блок фильтров размещается в модуле осветителя над объективом таким образом, что падающее освещение может направляться через фильтр возбуждения и отражаться от поверхности дихроматичного зеркала на образец. Флуоресценция, излучаемая образцом, собирается объективом и передается через дихроматичное зеркало на окуляры или в детектор. Наборы флуоресцентных фильтров подбираются по полосам пропускания в различных комбинациях так, чтобы свести к минимуму перекрестные помехи между фильтрами и увеличить регистрируемую интенсивность флуоресценции.
Флуоресцентная гибридизация “in situ” (методика FISH) - Fluorescence in situ Hybridization (FISH) – Не имея непосредственного отношения к рыбьему народу, методика FISH в флуоресценции основана на гибридизации изучаемой последовательности хромосомной ДНК с флуоресцентно маркированной однонитевой комплементарной последовательностью (называемой кДНК), которая используется для уточнения местоположения определенных генетических последовательностей. В методе, называемом «прямой FISH» флуорохромы связываются непосредственно с комплементарным зондом нуклеиновой кислоты для того, чтобы гибрид из зонда и изучаемой цепочки наблюдался в флуоресцентном микроскопе. В случае непрямого FISH флуоресцентно маркированное антитело связывается с комплементарным зондом после гибридизации с целью усиления флуоресцентного сигнала и увеличения количества флуорофоров, годных для различных экспериментов с маркированием.
Время высвечивания - Fluorescence Lifetime – Характерное время, в течение которого молекула сохраняется в возбужденном состоянии до возврата в спокойное. При нахождении в возбужденном состоянии флуорофор может подвергаться конформационным изменениям, в том числе и взаимодействуя с ближайшим окружением. Время высвечивания определяется как период, в течение которого интенсивность флуоресценции флуорофора снижается до 1/е (примерно 37%) от исходного уровня. Этот показатель является обратной величиной по отношению к постоянной затухания флуоресценции от возбужденного к спокойному состоянию.
FLIM-микроскопия - Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) – Комплексная методика, позволяющая одновременно регистрировать флуоресцентное высвечивание и пространственное распределение флуорофоров по всему изображению. Методика позволяет исследовать параметры окружающей среды, такие как pH, концентрация ионов, полярность растворителя и давление кислорода в единственной живой клетке, представляя данные в виде пространственной и временной зависимости. Измерения по методике FLIM наносекундных периодов высвечивания (из возбужденного состояния) не зависят от локальных концентраций флуорофоров, артефактов фотообесцвечивания и длины пробега (толщины образца), но чувствительны к реакциям возбужденного состояния, таким как резонансный перенос энергии.
Потеря флуоресценции при фотообесцвечивании (методика FLIP) - Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP) – В рамках метода FRAP определенный район живой клетки подвергается повторяющемуся фотообесцвечиванию путем интенсивного облучения светом. Спустя определенный период времени эти действия приведут к полной потере флуоресцентного сигнала по всей клетке, если флуорофоры способны диффундировать в облучаемый район клетки. Таким образом путем расчета скорости пропадания флуоресценции во всей клетке может быть определена диффузионная подвижность изучаемых флуорофоров.
Флуоресцентная микроскопия - Fluorescence Microscopy – Популярная клиническая и исследовательская разновидность оптической микроскопии, использующая возбуждение флуоресцентных молекул характерными длинами волн для получения изображений при помощи наведенного вторичного флуоресцентного излучения на более длинных волнах. Современные флуоресцентные микроскопы оснащены осветителями отраженного света, имеющими в своем составе нейтральные фильтры и специализированные комбинации интерференционных фильтров для разделения падающего света и флуоресцентного излучения.
Fluorescence and Phase Contrast Combination Microscopy – Комбинация флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии – Традиционная фазово-контрастная оптика может применяться в флуоресцентной микроскопии для наблюдения пространственного распределения флуорофоров в живых и фиксированных клетках и привязки интенсивности излучения к конкретным клеточным структурам и органеллам. В связи с тем, что методика фазового контраста требует применения освещения проходящим светом, прошедшим через кольцевую апертуру (кольцевой конденсор) и улавливаемым пространственным фильтром (фазовая пластина) расположенным в задней фокальной плоскости объектива, то для получения лучшего контраста необходимо осуществлять захват изображения независимо от флуоресценции. Полученные изображения затем комбинируются (накладываются) с пространственными диаграммами интенсивности флуоресценции, привязанными к структуре клетки. Некоторые производители предлагают фазовые пластины низкой плотности, позволяющие проводить одновременные наблюдения живых клеток фазово-контрастным и флуоресцентным методами.
Методика FRAP (восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания) - Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) – Поступательная подвижность (боковая диффузия) флуоресцентно маркированных макромолекул и небольших флуорофоров может определяться методом восстановления после обесцвечивания. Методика FRAP подразумевает интенсивное, обычно лазерное, облучение очень маленького (диаметром в несколько микрон) участка до полного фотообесцвечивания в нем флуорофоров. В результате облучения флуоресценция резко снижается или исчезает полностью. После окончания облучения ведется наблюдение за скоростью и степенью восстановления интенсивности флуоресценции на обесцвеченном участке для получения данных о перераспределении флуорофоров и динамике восстановления.
Флуоресцентная резонансная передача энергии (FRET) - Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) – Адаптация явления резонансной передачи энергии к флуоресцентной микроскопии для получения количественной временной и пространственной информации о связях и взаимодействии белков, липидов, ферментов и нуклеиновых кислот в живых клетках. FRET-микроскопия может выполняться в стационарном режиме или с помощью методики временного разрешения, однако FRET изображения с временным разрешением позволяют более точно определять распределение расстояний между донорами и акцепторами. Стандартный флуоресцентный микроскоп, оборудованный соответствующими фильтрами возбуждения, пропускания, а также чувствительной видеокамерой, может быть использован для получения изображений по методике FRET.
Флуоресцентная спекл-микроскопия (FSM) - Fluorescence Speckle Microscopy (FSM) – Методика, совместимая с широкопольной и конфокальной микроскопией, использующая образцы с очень низкой концентрацией флуоресцентно маркированных субъединиц (например, тубулин) для уменьшения флуоресценции вне фокальной плоскости и улучшения видимости маркированных структур и их динамики в обширных регионах живых клеток. Это достигается путем маркирования лишь небольшой части всей изучаемой структуры. Флуоресцентная спекл-микроскопия оказалась очень полезной для определения движения и кинетики полимеризации элементов цитоскелета в живых клетках, таких как актин и микротрубки.
Флуорохром - Fluorochrome – Натуральный или синтетический краситель или молекула, способные проявлять флуоресценцию. Флуорохромы (также называемые флуоресцентными молекулами, зондами или флуоресцентными красителями) это как правило многоядерные гетероциклические молекулы, содержащие азот, серу и/или кислород со смещенными электронными системами и реакционно-способными группами которые могут связываться с биологическими образцами.
Флуорофор - Fluorophore – Характерный структурный участок или область молекулы, способная проявлять флуоресценцию. Флуорофоры подразделяются на два главных класса – внутренние и внешние (intrinsic and extrinsic). Внутренние – это флуорофоры, от природы встречающиеся в составе биологических структур или других материалов. Внешние флуорофоры искусственно добавляются к образцам, не проявляющим необходимых спектральных (флуоресцентных)_ свойств. Во многих случаях флуорофор состоит из небольшой ароматической молекулы (флуорохрома), привязанной химически или абсорбционным путём к более крупной макромолекуле. Типичными примерами являются акридиновый оранжевый, внедренный между двумя последовательными парами основ ДНК, флуоресцеиновая доля, сопряженная с белком или антителом, а также тетрапирроловая кольцевая структура в хлорофилле.
Принцип Франка-Кондона - Franck-Condon Principle – Основная концепция, характеризующая явление флуоресценции, которая базируется на том факте, что в ходе электронных переходов ядра молекул остаются неподвижными (что отображается вертикальными линиями на диаграмме Франка-Кондона или Яблонски). Переходы электронов из спокойного состояния на уровни с более высокими энергиями проходят в течение таких коротких промежутков времени (фемтосекунды), за которые атомные ядра не успевают начать вибрировать. В результат единственно возможными электронными переходами из спокойного в возбужденное состояние являются те, для которых вероятности нахождения электронов в спокойном и возбужденном состояниях максимально перекрываются.
Полная ширина на половине максимума - Full Width at Half Maximum (FWHM) – Диапазон длин волн пропускаемых стеклянным или интерференционным фильтром описывается параметром, известным как полная ширина на половине максимума (FWHM). Границы среза определяются как наименьшая и наибольшая длины волн, пропускаемые фильтром на уровне 50% от максимума, а средняя длина волны (CWL или СДВ) представляет собой среднее арифметическое от всех длин волн внутри диапазона. Например, величина FWHM, равная 40 означает, что ширина пропускаемого диапазона волн составляет 40 нм, причем значение СДВ (CWL) может лежать где угодно от ультрафиолетовой до инфракрасной частей спектра. Во многих текстах FWHM может обозначаться как половинная полоса пропускания (half bandwidth, HBW).
Зеленый флуоресцентный белок - Green Fluorescent Protein (GFP) – Натуральный белковый флуоресцентный зонд, получаемый из медуз Aequorea victoria, и обычно используемый для определения местоположения, концентрации, взаимодействий и динамики изучаемых белков в живых клетках и тканях. Спектры возбуждения и испускания улучшенного GFP (генетическое производное) имеют максимумы на 489 и 508 нанометрах соответственно. Для того, чтобы внедрить GFP (или любой из его генетических производных) в клетку соответствующая последовательность ДНК накладывается на последовательность, кодирующую изучаемый белок. После того, как культивируемые клетки трансфицированы модифицированной ДНК они становятся способны выделять химерические флуоресцентные белки для наблюдения через микроскоп.
Микроскопия на гармонических волнах - Harmonic Generation Microscopy (HGM) – Гармоническое излучение появляется в случаях, когда оптическое возбуждение двумя или более фотонами характерной частоты порождает сопутствующее излучение на нескольких гармониках (как правило, второй и третьей) без поглощения фотонов. Излучение на гармонических частотах представляет собой нелинейный рассеянный процесс высвобождения фотона с длиной волны вдвое большей или вдвое меньшей (для второй гармоники) чем длины волны падающего излучения. В оптической микроскопии прозрачные несимметричные образцы являются идеальными кандидатами для изучения с применением гармонического излучения. В отличие от ситуации с обычными зондами и освещением в традиционной флуоресцентной микроскопии изменение длины волны излучения возбуждения приводит к соответствующим изменениям в испускаемых гармонических волнах. Кроме того, испускаемый свет является когерентным и сохраняет фазовую информацию об образце.
Горячее зеркало - Hot Mirror – Специализированный дихроматический интерференционный фильтр, используемый зачастую для защиты оптических систем путем отражения теплового потока обратно к источнику света. Горячие зеркала могут быть разработаны для установки в оптические системы с углом падения от нуля до 45 градусов и используются в многих случаях, когда подвод тепла может повредить отдельные компоненты или отрицательно сказаться на спектральных характеристиках источника освещения. Инфракрасное горячее зеркало отражает длины волн от 750 до 1250 нанометров. Горячие зеркала могут также использоваться в ряде специальных задач флуоресцентной микроскопии в качестве дихроматических светоделителей, так как пропускают видимый свет, отражая инфракрасные волны
Иммунофлуоресцентная микроскопия - Immunofluorescence Microscopy – Разновидность флуоресцентной микроскопии, в которой изучаемые разновидности молекул (белки, нуклеиновые кислоты, мембраны и т.д.) в образцах маркируются высокоспецифичными флуоресцентыми антителами. После возбуждения маркированных антител характерными длинами волн вторичное флуоресцентное излучение собирается объективом и формирует изображение образца. Антитела маркируются либо связыванием напрямую с флуорохромами (флуоресцентные красители, прямая иммунофлуоресценция) или же с другим флуоресцентным антителом, которое распознает эпитопы на первичном антителе (непрямая иммунофлуоресценция).
Видеокамеры ISIT - Intensifier Silicon-Intensifier Target (ISIT) Camera – Видеокамеры, предназначенные для работы при низком уровне освещения, как например в флуоресцентной микроскопии образцов с очень низким квантовым выходом. Эти камеры как правило включают в себя SIT – трубку (с диодной матрицей) дополненную усилителем изображения в комбинации с волоконной оптикой на первой ступени усиления света.
Интерференционный фильтр - Interference Filter – Фильтр, предназначенный для пропускания или отражения определенных длин волн или диапазонов, обычно используется в флуоресцентной микроскопии для отделения возбуждающего излучения от флуоресцентного. Интерференционные фильтры изготавливаются с использованием чередующихся слоев нескольких диэлектрических материалов или последовательных слоев диэлектрических материалов и тонких металлических пленок. Расстояния между диэлектрическими слоями (или между диэлектрическими и металлическими слоями) ограничены до четверти или половины длины волны для обеспечения усиливающей интерференции и прохождения определенных длин волн сквозь фильтр. Все прочие длины волн порождают ослабляющую (гасящую) интерференцию и поглощаются или отражаются, но не проходят через фильтр.
Собственное время жизни - Intrinsic Lifetime – Определяемое как время существования возбужденного состояния в отсутствие каких-либо процессов, приводящих к деактивации возбужденных электронов, собственное время жизни измеряется как величина обратная постоянной скорости спада флуоресценции. На практике измеренное время жизни флуорофора – это комбинация собственного времени жизни флуоресценции и нефлуоресцентных процессов (быстрое охлаждение, неизлучающее затухание и т.д.), приводящих к снятию возбужденного состояния. Измеренное время жизни всегда меньше собственного времени жизни и является индикатором квантового выхода.
Точка изосбестики - Isosbestic Point – Наблюдается, когда ведется запись спектра возбуждения или испускания флуорохрома, находящегося в равновесном состоянии под химическим или механическим воздействием, как функции концентрации каждого из взаимодействующих веществ. Кривые зависимостей испускания от длины волны (частоты) для компонентов такой смеси часто пересекаются в одной или нескольких точках, называемых isosbestic points. Эффект может проявляться также в спектрах для смеси двух или более неродственных и не реагирующих флуорохромов, имеющих одинаковую полную концентрацию. Для единственного химического препарата isosbestic points появляются на всех длинах волн, для которых молярные коэффициенты поглощения равны. В качестве примера можно привести спектр возбуждения флуорохрома fura-2, который имеет isosbestic point на длине волны 362 нанометра когда слабый раствор титруется кальцием.
Диаграмма Яблонски - Jablonski Diagram – графическое отображение энергетических уровней, занятых возбужденными и невозбужденными электронами в флуоресцирующей молекуле. Синглетное и триплетное возбужденные состояния обычно изображаются отдельно, но поблизости одно от другого. Диаграмма Яблонски определяет относительное положение энергетических состояний электрона и уровни колебательной энергии в виде последовательности горизонтальных линий. Переходы электронов между состояниями показываются прямыми вертикальными линиями (поглощение и излучение), а внутренние переходы, колебательная релаксация и охлаждение (quenching) передаются волнистыми вертикальными линиями. Интеркомбинационная конверсия между синглетным и триплетным состояниями отображается диагональными прямыми или волнистыми линиями.
Жидкокристаллический перестраиваемый фильтр - Liquid Crystal Tunable Filter (LCTF) – электронное устройство в оптической микроскопии, обеспечивающее фильтрацию светового потока без снижения качества изображения при сохранении открытой апертуры. Эти фильтры представляют собой последовательность волновых пластин, составленных из комбинации двоякопреломляющего материала и жидкокристаллического слоя, заключенных между двумя слоями линейного поляроида. Двоякопреломляющие свойства жидкористаллического слоя с большой точностью управляются изменением напряжения, подводимого к прозрачным проводящим подложкам, прилегающим к ж/к слою. Поляризованный свет, поступающий в фильтр, поворачивается в волновых пластинах на определенный угол в зависимости от длины волны, а затем ослабляется анализатором (вторым поляризующим фильтром). Фильтры LCTF созданы для управления параметрами фильтрации путем изменения характера двойного преломления жидких кристаллов и использования последовательности волновых пластин.
Фильтр верхних частот (ФВЧ) - Longpass (LP) Filter – Оптический интерференционный или цветной стеклянный фильтр, ослабляющий короткие волны и пропускающий длинные волны из определенного диапазона спектра (ультрафиолетового, видимого или инфракрасного). ФВЧ, которые могут иметь очень крутой скат, характеризуются длиной волны среза при 50-% пропускании. В флуоресцентной микроскопии ФВЧ часто используются в дихроматичных зеркалах и барьерных фильтрах (фильтрах испускания). В настоящее время в английском языке преимущественно используется термин “longpass ” вместо устаревшего “ highpass ”, который относился в большей степени к частоте, нежели к длине волны.
Люминесценция - Luminescence – Излучение света любым веществом (как правило, молекулой или атомом) из возбужденного электронного состояния, полученного в результате физического (поглощение света), механического или химического воздействия. Формально люминесценция подразделяется на две категории – флуоресценцию и фосфоресценцию, в зависимости от электронной конфигурации возбужденного состояния и траектории излучения. Люминесценция может возникать в результате возбуждения фотонами ультрафиолетового или видимого света (фотолюминесценция), электронным лучом (катодолюминесценция), химической энергией (хемилюминесценция), биохимической реакцией под воздействием ферментов (биолюминесценция) или энергией механического воздействия (триболюминесценция), например, трением.
Микроканальная пластина - Microchannel Plate – Пластина, состоящая из компактного множества капиллярных трубок с металлизированными стенками, разработанная в качестве усиливающего элемента для электронно-оптических преобразователей 2-го и более поздних поколений (по классификации Лаборатории ночного видения Армии США – перев.). Фотоэлектроны с мишени ускоряются перед попаданием на пластину, претерпевают в трубках множественные столкновения, порождая тем самым поток электронов, многократно усиливающий исходный сигнал от падающего фотона. Микроканальные пластины эффективно используются в флуоресцентной микроскопии для усиления очень слабых сигналов.
Правило зеркального отображения - Mirror Image Rule – Спектр флуоресцентного излучения представляет собой зеркальное отражение спектра возбуждения, если его представлять как функцию относительной интенсивности от волнового числа (в противоположность длине волны). Так происходит потому, что вероятность возвращения возбужденного электрона на определенный колебательный энергетический уровень в основном состоянии связана со степенью сходства между уровнями колебательной и вращательной энергии в основном состоянии и их же уровнями в возбужденном состояниями. В действительности, наиболее вероятным переходом при возбуждении электрона из нулевого колебательного основного состояния на второй колебательный уровень в первом возбужденном состоянии будет переход с нулевого колебательного уровня в возбужденном состоянии на второй колебательный уровень в основном состоянии (возбуждение из S(0)=0 в S(1)=2, с последующим излучением из S(1)=0 в S(0)=2).
Молярный коэффициент затухания - Molar Extinction Coefficient – Широко применяемые в спектроскопии, микроскопии и флуоресценции, молярные коэффициенты затухания как правило обозначаются буквой эпсилон (ε) древнегреческого алфавита и используются для преобразования единиц поглощения в единицы молярной концентрации для многих химических веществ. Коэффициент затухания определяется измерением поглощения на характерной длине волны (характеристика поглощающей молекулы) для единичной молярной (М) концентрации (1 моль на литр) заданного вещества в кювете с длиной траектории в 1 сантиметр. За характерную, как правило, принимается длина волны с максимальным поглощением в ультрафиолетовом или видимом диапазоне спектра. Коэффициент затухания – это непосредственная мера способности молекулы поглощать свет.
Монохроматический - Monochromatic – Луч света, имеющий единую длину волны. Понятие монохроматического света легко представимо, однако, ввиду принципа неопределенности Гейзенберга, в природе не существует. В действительности монохроматический свет не ограничен единственной длиной волны, а представляет собой колебания в узком диапазоне длин, включающим в себя две или более длины волн. Даже монохроматическое излучение лазера, полученное от возбужденного атомного источника или узкого полосового интерференционного фильтра имеет измеримую ширину.
Сложный (многоступенчатый) флуоресцентный фильтр - Multiple Fluorescence Filter Set – Разработанный для одновременного наблюдения, микрофотографии или цифровой записи нескольких флуоресцентных сигналов, этот фильтр представляет собой комбинацию специализированных интерференционных фильтров, настроенных для пропускания двух или более диапазонов длин волн. Профиль пропускания каждого фильтра в комбинации имеет множественные вершины и впадины для пропускания и отражения характерных диапазонов возбуждения и испускания, наподобие обычной комбинации фильтров для одного зонда. Погрешности записи и сдвиги картинки, которые появляются при последовательной регистрации изображений с несколькими комбинациями фильтров пропадают при использовании сложного фильтра. Тем не менее, ограничения ширины диапазона, связанные с невозможностью отсечь определенные длины волн и ограниченной крутизной профилей пропускания приводит к тому, что сложный фильтр в целом имеет более низкие характеристики по сравнению с индивидуальными фильтрами для специфичных флуорохромов.
Ближнепольная сканирующая оптическая микроскопия (БСОМ - Near-Field Scanning Optical Microscopy (NSOM)) – Ближнепольное изображение получается при размещении оптического зонда (световода) субмикронного размера на чрезвычайно близком расстоянии от изучаемого объекта, а свет пропускается через небольшую диафрагму на конце зонда. Под ближним полем понимается зона над поверхностью изучаемого объекта размером меньше длины волны падающего света. В пределах ближнего поля затухающий свет не ограничен дифракцией, и возможно получение информации относительно объектов нанометрового порядка. Это явление позволяет получать изображения за пределами дифракционного барьера и проводить спектроскопию образцов, недостижимую средствами обычной оптической микроскопии.
Нейтральный фильтр - Neutral Density (ND) Filter – Нейтральные фильтры используются в оптической микроскопии для решения широкого круга задач, представляют собой бесцветные (серые) фильтры, напоминающие закопченное стекло и предназначены для снижения интенсивности проходящего света на конкретных длинах волн или для всего оптического диапазона, не изменяя соотношения спектральных составляющих света. Нейтральные фильтры идеальны для контроля интенсивности освещения в флуоресцентной микроскопии, так как отсутствует возможность управлять световым потоком используемых для освещения дуговых ламп путем изменения подводимой электрической мощности.
Диск Нипкова - Nipkow Disk – Тонкий непрозрачный диск с большим количеством небольших отверстий, последовательно расположенных от края к центру на одинаковых угловых расстояниях друг от друга. Используется в конфокальной микроскопии для прямого наблюдения получаемого изображения или для его регистрации высокочувствительной камерой. В противоположность этому традиционные однолучевые сканирующие устройства формируют изображение, которое восстанавливается из сигналов, генерируемых фотоумножителем и показываемых на экране монитора. Диск Нипкова содержит тысячи небольших отверстий с размерами, близкими к дифракционному пределу, которые осуществляют параллельное сканирование образца в процессе быстрого вращения диска. Флуоресцентное излучение от образца перефокусируется на те же отверстия (микродиафрагмы) в диске, отсекая тем самым свет, поступающий извне конфокальной плоскости, как это происходит в конфокальных микроскопах.
Оптические (молекулярные) маркеры - Optical (Molecular) Highlighters – Уникальная группа флуоресцентных белков, которая может менять спектр излучения под воздействием характерных длин волн (как правило, лазерного излучения). Белковые хромофоры, которые могут быть активированы из пассивного состояния до способности к флуоресценции (процесс известен под названием «фотоактивация») или могут быть оптически переведены в состояние, при котором излучается другой диапазон волн (фотоконверсия), позволяют осуществлять непосредственное управляемое выделение определенных групп молекул внутри клеток.
Оптические пинцеты (лазерные захваты) - Optical Tweezers (Laser Trapping) – Оптические пинцеты, называемые еще однолучевыми лазерными захватами используют лучевое давление потока фотонов, излучаемых инфракрасным лазером для захвата и перемещения микроскопических объектов, таких, как микрогранулы в оболочке из белка. Эта методика применяется для измерения сил, возникающих при движении белков, а также сил клеточной адгезии. Хотя чаще всего лазерные захваты применяются в широкопольной флуоресцентной микроскопии, они могут быть также использованы и в составе конфокальных и мультифотонных систем.
Термоэлектрическое охлаждение Пельтье - Peltier Thermoelectric Cooling – Являясь стандартным компонентом цифровых камер, разработанных для флуоресцентной микроскопии, системы охлаждения Пельтье представляют собой биметаллические пластины, становящиеся горячими с одной стороны и холодными с другой при прохождении через них электрического тока. Эти устройства могут использоваться для быстрого и эффективного охлаждения ПЗС-матриц в замкнутом пространстве на 50-60 градусов ниже окружающей среды. Охлажденные ПЗС-камеры могут накапливать заряд на фотодиодах без заметного увеличения уровня шума в течение гораздо более длительного периода, чем обычные неохлаждаемые устройства.
Фосфоресценция - Phosphorescence – Излучение света (фотонов) из возбужденного триплетного состояния, при котором электроны на возбужденных орбиталях имеют такую же ориентацию спина, что и их партнеры в спокойном состоянии. Так как переход из триплетного состояния в спокойное запрещен правилами квантовой механики, излучение фосфоресценции происходит намного медленнее (от миллисекунд до секунд), чем это происходит в случае флуоресценции. Как правило в наиболее часто встречающихся химических и биохимических средах при комнатных температурах фосфоресценция не встречается.
Фотоактивация - Photoactivation – Генетически кодированные флуоресцентные белки, почти не флуоресцирующие под воздействием обычного излучения возбуждения, но значительно повышающие флуоресценцию после активации путем облучения другой, как правило, низшей, частотой называются фотоактивируемыми. Среди белков, демонстрирующих фотоактивацию наиболее широко изучен вариант зеленого флуоресцентного белка PA-GFP.
Фотообесцвечивание (выгорание) - Photobleaching (Fading) – Стойкая потеря молекулой способности к флуоресценции из-за химического повреждения или ковалентной модификации под воздействием фотона. В общем фотообесцвечивание происходит, когда флуорохром подвергается интеркомбинационной конверсии из возбужденного синглетного триплетное состояние. Молекулы в триплетном состоянии легко претерпевают изменения в ходе сложных химических реакций с соседними молекулами или кислородом. Последний вид реакций окончательно разрушает флуорохром и вдобавок производит синглетные кислородные свободные радикалы, которые в состоянии химически модифицировать другие биомолекулы. После фотообесцвечивания флуорохром, как правило, не восстанавливается. Интенсивность фотообесцвечивания может быть существенно снижена при уменьшении светового потока или ограничении концентрации кислорода.
Фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) - Photomultiplier Tube (PMT) – Электрическое устройство, созданное для сбора и усиления слабых световых сигналов. Фотоны, падающие на активную поверхность фотоэлектронного умножителя выбивают свободные электроны, которые ускоряются (электрическим полем) и попадают на поверхность вторичного электрода, который в свою очередь высвобождает усиленный поток электронов. В итоге последовательность вторичных электродов из каждого падающего фотона генерирует мощный поток электронов и подает усиленный сигнал в модуль обработки. В отличие от матричных детекторов, таких как приборы с зарядовой связью (ПЗС), фотоэлектронные умножители не формируют изображение.
Фототоксичность - Phototoxicity – Вред, наносимый образцу живой ткани в результате длительного воздействия интенсивного облучения. Уровень фототоксичности в целом увеличивается с уменьшением длины волны облучения, однако множественные механизмы, приводящие к этому явлению, плохо изучены. Большинство живых клеток демонстрируют повышенный уровень фототоксичности при одновременном воздействии синтетических флуорофоров на определенные суб-клеточные структуры, такие как ядро, митохондрии, аппарат Гольди или эндоплазматическая сеть.
Микродиафрагма (также кратер) - Pinhole – В конфокальной микроскопии изменяемые диафрагмы малой апертуры, помещенные около источника света и детектора и позволяющие микроскопу создавать изображения очень тонких оптических срезов образца. Применительно к фильтрам термин «кратер» может означать миниатюрные нарушения сплошности покрытия (главным образом в тонких пленках интерференционных фильтров) из-за мельчайших частиц пыли или инородных включений в субстрате во время их использования. Величина микродиафрагмы измеряется в безразмерных единицах относительно стандартной величины, измеренной в определенных условиях при освещении высокой интенсивности.
Полихроматичное зеркало (полихроичный светоделитель) - Polychromatic Mirror (Polychroic Beamsplitter) – Специализированное зеркало или светоделитель, созданный для передачи множественных полос пропускания флуоресцентного излучения от образца, отражая при этом прочие характерные длины волн, относящиеся к возбуждающему излучению. Полихроматичные зеркала являются ключевыми компонентами многополосных комбинаций фильтров, разрабатываемых с целью устранения нежелательных наводок при работе нескольких флуоресцентных зондов на одном образце. Наиболее сложные полихроматичные зеркала могут отражать три или более полос возбуждения и пропускать не менее трех полос испускания.
Квантовая эффективность - Quantum Efficiency – Термин, используемый производителями светочувствительных матриц, характеризует способность светочувствительной матрицы (например, прибора с зарядовой связью, ПЗС) генерировать электронный заряд под воздействием падающих фотонов. Количественно квантовая эффективность характеризует число электронов, генерируемых фотодиодом на каждый падающий фотон за характерный промежуток времени. Квантовая эффективность меняется с длиной волны падающего света из-за зависимости коэффициента поглощения подложки от частоты поступающего излучения. На практике на зависимость квантовой эффективности от длины волны влияет еще и интерференция из-за тонкой пленки диоксида кремния, нитрида кремния и поликристаллического кремния на поверхности матрицы. Большинство производителей в целях сравнения представляют квантовую эффективность светочувствительных элементов в виде графика функции от длины волны.
Квантовый выход - Quantum Yield – Количественное измерение эффективности флуоресцентного излучения – квантовый выход флуорохрома или флуорофора - выражается как отношение количества излученных к количеству поглощенных фотонов. Другими словами, квантовый выход характеризует вероятность того, что данный возбужденный флуорохром произведет излученный (флуоресцентный) фотон. Величина квантового выхода изменяется, как правило, в диапазоне от 0 до 1, и флуоресцентные молекулы применяемые в качестве зондов в микроскопии могут иметь квантовый выход от очень низкого уровня – 0,05 или менее, до практически единицы. В целом для большинства применений желателен высокий квантовый выход. Квантовый выход конкретного флуорофора может порой принимать крайние значения в зависимости от факторов окружающей среды таких, как pH, концентрация и полярность растворителя.
Гашение - Quenching – Снижение флуоресцентного излучения флуорохрома из-за окружающих условий, таких как ионная сила, pH, эффект растворителя или высокая локальная концентрация флуорохромов, снижающая выход излучения. Проявляется в виде неизлучающего перехода электронов из возбужденного состояния в спокойное. Возбужденные флуорофоры могут погаснуть из-за резонансного переноса энергии, если находятся в непосредственной близости к молекулам – акцепторам, воспринимающим энергию возбужденного состояния.
Красный флуоресцентный белок - Red Fluorescent Protein (RFP) - Флуоресцентный белок, получаемый из морских анемонов, принадлежащих к роду Discosoma, используемый для определения местоположения, концентрации, взаимодействий и динамики изучаемых белков в живых клетках и тканях. Для того, чтобы внедрить RFP в клетку соответствующая последовательность ДНК накладывается на последовательность, кодирующую изучаемый белок. После того, как культивируемые клетки трансфицированы модифицированной ДНК они становятся способны выделять химерические флуоресцентные белки для наблюдения через микроскоп.
Резонансный перенос энергии - Resonance Energy Transfer (RET) – Процесс, в ходе которого флуорофор-донор в возбужденном состоянии может передать энергию возбуждения соседней (не далее 10 нанометров) молекуле хромофора неизлучающим путем, посредством взаимодействия типа «диполь-диполь». Для передачи энергии этим способом необходимо, что бы диапазон испускания донора перекрывался с диапазоном поглощения акцептора. Перенос энергии проявляет себя снижением флуоресценции донора в присутствии акцептора и увеличением флуоресцентной эмиссии (активацией) акцептора.
Царапины и ямки - Scratches and Digs – Дефекты, находящиеся на оптических поверхностях, которые измеряются в единицах, устанавливаемых военными стандартами. Царапины – это дефекты,, длина которых намного превосходит ширину, а термин «ямки» применяется к частичкам и небольшим пузырькам, заключенным в слое или находящимся на поверхности покрытия фильтра. Толщина царапин измеряется и указывается в микронах, а диаметр включений, ямок и пузырьков регистрируется в единицах, кратных 10 микрометрам. Например, параметр, характеризующий царапины и ямки фильтра как 80/50 устанавливает предельную величину в 80 микрометров для ширины царапин и 500 микрометров для ямок. Спецификация фильтра также ограничивает количество дефектов, допустимое на всей поверхности фильтра.
Фильтр нижних частот (ФНЧ) - Shortpass (SP) Filter – Оптический интерференционный или цветной стеклянный фильтр, ослабляющий низкочастотное и пропускающий высокочастотное излучение из заданного спектрального диапазона (как правило, ультрафиолетовое и видимое излучение). ФНЧ, которые могут иметь очень крутой скат, характеризуются длиной волны среза при 50-% пропускании. В флуоресцентной микроскопии ФНЧ часто применяются в дихроматичных зеркалах и фильтрах возбуждения. В настоящее время в английском языке преимущественно используется термин “shortpass” вместо устаревшего “lowpass”, который относился в большей степени к частоте, нежели к длине волны.
Отношение сигнал/шум - Signal-to-Noise Ratio (S/N) – Стандартное отношение уровня оптического сигнала от образца к оптическому шуму окружающего образец фона. Шум определяется как квадратный корень из суммы составляющих его компонентов. В случаях, когда шум ограничен единичными фотонами а фоновый шум может быть приблизительно вычислен как квадратный корень из фонового сигнала, отношение сигнал/шум определяется как количество стандартных отклонений, которые отличают полезный сигнал с образца от среднего фонового сигнала. В флуоресцентной микроскопии отношение сигнал/шум может ухудшаться за счет высокого фонового сигнала из-за несовершенной техники окрашивания или очень низкого уровня сигнала от применяемого зонда.
SIT-камера - Silicon-Intensifier Target (SIT) Camera – Специализированная видеокамера, предназначенная для работы при низком освещении, которое часто встречается в флуоресцентной микроскопии. SIT-камера содержит фотокатод, который ускоряет фотоэлектроны, падающие на матрицу кремниевых диодов для существенного усиления сигнала. Затем сканирующий электронный луч нейтрализует заряд матрицы, генерируя при этом ток луча, содержащий полезный сигнал.
Синглетное состояние - Singlet State – Для любой многоэлектронной системы (в атомах и молекулах) когда спины электронов спарены, электронная конфигурация считается синглетным состоянием. Спиновое квантовое число (S) атома или молекулы – это абсолютная величина суммы электронных спинов в системе. Кратность такой системы определяется как 2S + 1, а для двухэлектронной системы в синглетном состоянии с антипараллельными (спаренными) спинами кратность равна единице, а спиновое число – нулю.
Спектральное построение изображений - Spectral Imaging – передовая флуоресцентная технология, использующая аппаратный модуль, обычно включенный в состав детекторного модуля конфокального микроскопа, для разделения света, излучаемого различными флуорофорами, на отдельные спектральные составляющие. Совместно с аппаратным модулем применяется вычислительный процесс линейного разделения (деконволюция), который использует спектры от каждого флуорофора как функции рассеяния точки с фиксированным местоположением, для разделения (сепарации) компонентов из состава полного сигнала. Технология служит эффективным аналитическим средством, которое может использоваться для разделения сигналов от различных флуорофоров с сильно перекрывающимися спектрами.
Установившаяся флуоресценция - Steady-State Fluorescence – в большинстве экспериментов с флуоресценцией при постоянном освещении (получение изображений, проведение измерений и т.д.), а также при наблюдениях установившаяся флуоресценция является самым применяемым видом флуоресценции. Образец освещается непрерывным отфильтрованным лучом света, а интенсивность флуоресценции или спектр излучения регистрируется детектором. Большинство образцов, изучаемых в флуоресцентной микроскопии, достигают установившегося состояния сразу же после освещения возбуждающим излучением.
Микроскопия с подавлением вынужденного излучения (STED) - Stimulated Emission Depletion Microscopy (STED) – Микроскопия STED – развивающаяся технология, позволяющая получать пространственное разрешение за дифракционным пределом, Для этого используются оппозитные объективы, позволяющие получать осевое разрешение менее 50 нанометров. Флуоресценция возбужденных молекул на периферии пятна сканирующего лазерного луча снижается при помощи синхронизации лазерных импульсов, возбуждающих флуорофоры и пространственно скоординированных кольцевых STED-импульсов, вызывающих истощение периферийной флуоресценции. В результате флуоресценция значительно снижается на периферии пятна облучения, но не в его центре, что сказывается на значительном повышении разрешения.
Смещение Стокса (Стоксов сдвиг) - Stokes Shift – Разность энергии или длины волны поглощаемого и испускаемого фотонов в процессе флуоресценции обычно называется смещением Стокса в честь Джорджа Стокса, который первым наблюдал это явление во время обучения в Кембриджском университете. На практике смещение Стокса определяется разностью длин волн максимумов возбуждения и испускания в спектрах флуоресцентных молекул. Эта величина широко варьируется в зависимости от электронной конфигурации флуорохрома и может принимать значение от нескольких единиц до нескольких сотен нанометров. В частности, для флуоросцеина смещение Стокса составляет приблизительно 20 нанометров, в то время как для порфирина превышает 200 нанометров. Смещение Стокса является очень важным параметром для флуоресцентной микроскопии, так как оно позволяет изолировать спектры возбуждения и испускания при помощи интерференционных фильтров.
Кривизна поверхности (фильтры) - Surface Flatness (Filters) – Широко применяемый в оптике, термин характеризует отклонение формы поверхности оптического элемента от совершенной плоскости. У флуоресцентных фильтров для оптической микроскопии кривизна поверхности измеряется в долях или единицах, кратных длине волны зеленого (550 нм), красно-оранжевого (630 нм) света или средней длине волны полосы пропускания характерного полосового фильтра. Когда плоский фронт волны отражается от поверхности зеркала или фильтра, искажение фронта отраженной волны равно удвоенной кривизне поверхности оптического элемента. У дихроматических зеркал кривизна поверхности определяется искажением фронта волны, отраженной от фронтальной (отражающей) поверхности.
Тонкопленочное интерференционное покрытие - Thin-Film Interference Coating – Являясь основным компонентом интерференционных фильтров, эти покрытия изготавливаются путем комбинации чередующихся слоев нескольких диэлектрических материалов или последовательных слоев диэлектрического материала и тонкой металлической пленки. Величина зазора между диэлектрическими слоями (или между диэлектрическим и металлическим слоями) ограничена четвертью или половиной длины волны проходящего света с целью создания условий для конструктивной интерференции и усиления прохождения через фильтр света с характерной длиной волны. Все иные длины волн порождают деструктивную (гасящую) интерференцию и поглощаются или отражаются фильтром, ноне проходят сквозь него. Каждый слой интерференционного покрытия бесцветен, но отражения на многочисленных границах слоев выборочно отражают некоторые длины волн и пропускают другие, придавая таким образом фильтру видимость цвета.
Флуоресценция с временным разрешением - Time-Resolved Fluorescence – Применяемые для измерения интенсивности или анизотропного затухания, измерения флуоресценции с временным разрешением основаны на подсветке образцов короткими импульсами света, длительность которых, как правило, меньше времени послесвечения флуорофора. Затухание интенсивности флуоресцентного излучения обычно записывается при помощи скоростного детектора, который позволяет измерять интенсивность и анизотропию в наносекундном масштабе.
Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения - Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) – Методика, разработанная для исследования поверхности флуоресцентно маркированных живых клеток при помощи затухающих волн, генерируемых лучом света, проходящим между двумя средами с разными коэффициентами преломления. На практике падающий лазерный луч отражается под критическим углом (полного внутреннего отражения) когда встречает границу раздела между покровным стеклом и водной средой, содержащей изучаемые клетки. Флуорофоры, находящиеся в пределах нескольких нанометров от поверхности, возбуждаются затухающим лучом, а расположенные дальше остаются нетронутыми. Методика обычно применяется для исследования взаимодействия молекул с поверхностями, что является очень важным в целом ряде областей применения в клеточной и молекулярной биологии.
Искажение фронта пропущенной волны - Transmitted Wavefront Distortion (TWD) – Степень искажения, вносимого в плоский фронт волны при ее прохождении через оптический элемент. Измеряется в долях или множителях от длины волны. Искажение является результатом неровной внешней поверхности оптического элемента и неоднородности его оптической плотности.
Триплетное состояние - Triplet State – В любой многоэлектронной системе (в атомах и молекулах) когда спины электронов являются неспаренными, электронная конфигурация называется триплетным состоянием. Также для равных величин прочих квантовых чисел состояния высшей кратности являются состояниями с меньшей энергией. Поэтому возбужденное триплетное состояние имеет меньшую энергию, чем соответствующее синглетное состояние. Спиновое квантовое число (S) для атома или молекулы это абсолютная величина суммы спинов электронов в системе. Кратность такой системы определяется как величина 2S + 1, при этом для двухэлектронной системы в триплетном состоянии с параллельными (неспаренными) спинами квантовое число равно 1, а кратность равна 3.
Двухфотонная (мультифотонная) микроскопия - Two Photon (Multiphoton) Microscopy – Методика, производная от лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, при которой возбуждение флуорохромов осуществляется лазерным излучением инфракрасного или длинноволнового видимого диапазона, плотность которого удваивается или даже утраивается в месте фокусировки на образце. Флуорофоры образца переводятся в возбужденное состояние двумя или тремя длинноволновыми фотонами, что эквивалентно возбуждению одним коротковолновым фотоном. Например, возбуждение двумя или тремя фотонами с длиной волны 900 нм эквивалентно возбуждению одним фотоном с длиной волны 450 или 300 нм. Мультифотонная микроскопия обеспечивает более глубокое проникновение в толщу тканей и не требует наличия конфокальной микродиафрагмы, так как ее флуоресценция возникает строго в фокальной плоскости.
Объемное моделирование - Volume Rendering – Методика, использующая математические алгоритмы для выполнения компьютерной визуализации трехмерных изображений, видимых под произвольными углами без промежуточного преобразования данных о геометрии поверхности объекта. В лазерной сканирующей конфокальной микроскопии объемное моделирование обычно осуществляется на основе последовательностей оптических сечений флуоресцентных образцов для создания воображаемой модели образца в трех измерениях.
Клиновидность - Wedge (Parallelism) – Отклонение от параллельности наружных поверхностей плоского оптического элемента (фильтра или стекла), измеряемое в угловых секундах или минутах. Значительная величина клиновидности вызывает угловое отклонение фронта волны, проходящей через этот элемент, что в свою очередь приводит к смещению изображения и ошибкам в его записи. Для типичных фильтрующих элементов или стекол величина углового отклонения составляет приблизительно половину от величины клиновидности. Клиновидные артефакты на поверхностях внутренних покрытий могут привести к появлению фантомных (паразитных) изображений в результате внеосевых внутренних отражений.
Масштабирование - Zoom – В лазерной сканирующей конфокальной микроскопии управление масштабированием позволяет существенно изменять площадь сканируемого растра на образце и тем самым обеспечивает постоянный контроль размера пиксела в плоскости образца (x-y). Управление масштабированием помогает оптимизировать информационную насыщенность изображения и обеспечить функционирование микроскопа в соответствии с критерием дискретизации Найквиста/Шэннона, требующим более двух пикселов для отображения минимально различимой оптической точки. Управление масштабированием модулирует степень отклонения сканирующих зеркал путем изменения величин тока гальванометра.
