Критические аспекты конфокальной микроскопии - Микросистемы

5 Марта 2017

На рисунке 1 показана блок-схема лазерного сканирующего конфокального микроскопа, содержащая в себе «39» факторов, упомянутых в тексте. В основу изображенной системы положен инвертированный оптический микроскоп, настроенный на визуализацию живых клеток. Отдельные компоненты, ссылки на которые есть в нижеследующем тексте, отмечены буквами (a) — (g). На рисунке также изображены три оптических среза, полученные на разных уровнях по оси z при наблюдении эмбриона дрозофилы, меченного антителами и обозначенные Z1, Z2 и Z3.

www_microsystemy_ru_articles_Critical_Aspects_of_Confocal_Microscopy

Рис. 1. Создание 3-D изображений и визуализация в конфокальной микроскопии

Для подробного ознакомления с медицинской и исследовательской техникой основных мировых производителей оптических систем и сопутствующего оборудования посетите наш каталог или свяжитесь с нашими специалистами и получите полную профессиональную консультацию по любым, имеющимся у Вас, вопросам. 

За время существования курсов по трехмерной микроскопии живых клеток, проводимых каждый год в июне в университете Британской Колумбии, студенты — слушатели курсов — составляли список этих внешних факторов. В первый год список вырос до 39 пунктов, поэтому его название было заимствовано у фильма Альфреда Хичкока. 

Хотя в этой статье невозможно описать каждый термин, в нее включены некоторые краткие и полезные объяснения. Термины выделены жирным шрифтом, и многие связаны между собой. Надо иметь в виду, что многие из этих переменных обычно понимаются в смысле их влияния на пространственное разрешение. Они приведены здесь, потому что под уменьшенным разрешением понимается «попадание такого же числа фотонов возбуждения на большую площадь». Это понижает интенсивность возбуждения — количество фотонов, испускаемых данной молекулой — и долю зарегистрированных фотонов. Обычно забывается, что нормальный уровень сигналов во флуоресцентной конфокальной микроскопии соответствует всего лишь 10–20 фотонам на пиксель в самых ярких областях. В этих условиях флуктуационный шум накладывает на пространственное разрешение более строгое ограничение, чем определяемое уравнением Аббе:

dmin = λ0 / (NAobj + NAcond)

В этом уравнении d(min) является минимальным различимым расстоянием в периодической решетке, что в нашем случае является поперечным расстоянием в пространстве образца; λ(0) длина волны света в вакууме; NA(obj) и NA(cond) числовые апертуры объектива и линзы конденсора, соответственно. Уравнение устанавливает связь числовой апертуры объектива и линзы конденсора с разрешением изображения на данной длине волны.

Лазерный модуль (рисунок 1(a)) — это источник освещения, и, в целом, измеряемая флуоресценция пропорциональна мощности лазера. Хотя общая выходная мощность лазера обычно регулируется, этого нельзя сказать о мощности на каждой длине волны в случае многоволнового лазера, более того, она может значительно меняться во времени. Оптические характеристики зависят от длины волны, которая через спектр поглощения красителя определяет количество света флуоресценции.

Нестабильность выходной мощности — это, как правило, шум; обычно, она менее 1 процента, но может значительно возрасти по мере износа лазера. Поскольку пыль, разюстировка и механическая нестабильность могут вызывать случайные изменения в пределах 10–30 процентов, эффективность оптической связи с волоконным световодом (если используется) является критической.

Отражательная способность и соосность (юстировка) зеркал лазера могут быть причиной долговременного дрейфа выходного сигнала лазера. Поскольку положение источника лазерного излучения определяется зеркалами лазера, погрешность наведения луча/юстировки являются важными характеристиками. Нестабильность здесь проявится в виде изменения яркости, поскольку изменение положения источника излучения повлияет на эффективность оптики, направляющей лазерный свет в одномодовое оптоволокно, используемое в большинстве приборов.

От числовой апертуры объектива (рисунок 1(b)) зависит, какая доля света, испускаемого источником, будет собрана. Это относится и к свету, генерируемому лазерным излучателем. Увеличение объектива находится в обратной зависимости к диаметру входного зрачка линзы объектива. Объектив работает нормально, только если весь входной зрачок заполнен светом возбуждения лазера. Неполностью заполненный зрачок приводит к уменьшению пространственного разрешения и падению пиковой интенсивности, а переполнение — к потере части света из-за попадания части лазерного излучения на металлическую оправу объектива, и, соответственно, потерю части излучения, что также уменьшает интенсивность светового пятна.

Чистота компонентов системы имеет очень важное значение, поскольку загрязненная оптика создает расплывчатые и тусклые световые пятна. Коэффициент пропускания (часть света, падающего на объектив, которая фокусируется в точку на его другой стороне) зависит от длины воны. Будьте осторожны с использованием некоторой относительно новой, оптики с многослойными покрытиями в ИК-диапазоне. Хроматическая и сферическая аберрации увеличивают пятно света и меняются с длиной волны. К тому же, на сферическую аберрацию сильно влияет толщина покровного стекла и показатель преломления иммерсионной среды и промежуточной среды.

Дифракция является непреодолимым ограничением оптического разрешения. Она существенно размывает объекты, меньшие дифракционного предела, понижая при этом их яркость.

Сканирующая система (рисунок 1(с)), и, особенно, управление трансфокатором (регулировка увеличения), определяют размер пикселя образца. Для выборки Найквиста пиксель должен быть, по крайней мере, в два раза меньше наименьшей детали, которую вы хотите различить в образце. Если по критерию Релея разрешение составляет 200 нанометров, то пиксели должны быть менее 100 нанометров. Субдискретизация при пикселях большего размера приведет к падению яркости мелких деталей.

Интенсивность обесцвечивания пропорциональна площади масштабирования. Что касается скорости сканирования, то чем больше время задержки на определенном пикселе, тем больший сигнал будет получен и тем меньше он будет искажен пуассоновским шумом. При высокой скорости сканирования (менее 100 наносекунд/пиксель), сигналы от красителей с постоянной затухания флуоресценции большей времени задержки, могут уменьшаться.

Размер растра — Наряду с трансфокацией (масштабированием), количество пикселей по краям вашего растра определяет размер пикселя. Большее количество пикселей (1024×1024 против 512×512) уменьшает субдискретизацию, но означает, что необходимо либо уменьшать время задержки на каждом пикселе, сокращая при этом количество полученных от него фотонов и увеличивая пуассоновский шум, либо увеличивать время сканирования, что может вызвать более сильное обесцвечивание наблюдаемого образца. Оптика и сканирующие зеркала могут вносить геометрическое искажение (дисторсию) изображения, приводящее к несоответствию формы предмета и его изображения. Большое значение имеет окружающая среда: различное оборудование, например охлаждающие вентиляторы, могут быть источниками вибрации и рассеянных электромагнитных полей. Это может вызвать неправильное отклонение зеркал, что приводит к возникновению дисторсии, которая может изменяться во времени.

Другие оптические компоненты характеризуются коэффициентом пропускания, который определяет степень отсутствия потерь на поглощение и отражение в этих компонентах, особенно в нейтральных и полосовых фильтрах, светоделителях и объективах. Отражения на поверхностях раздела воздух/стекло обычно приводят к потере сигнала, но могут проявляться как яркие пятна, не связанные со структурой образца. Коэффициент отражения зеркал может сильно зависеть от длины волны в инфракрасной и ультрафиолетовой области спектра и падает с во влажной и пыльной среде.

К выбору толщины покровного стекла (самого дешевого оптического компонента) обычно подходят наиболее небрежно. Она должна составлять 170 ± 5 микрометров. А что касается иммерсионного масла, то его коэффициент преломления должен строго соответствовать используемому объективу. Это возможно лишь в малом диапазоне температур, но оно может быть и специально смешанным. Немаловажно также положение фокальной плоскости, поскольку элемент выше или ниже нее будет казаться более тусклой по сравнению с элементом, расположенным на самой фокальной плоскости. При трехмерной визуализации, выборку Найквиста необходимо использовать и при сканировании z-плоскостей. В конце концов, простое механическое смещение предметного столика может привести к изменению изображаемой плоскости предмета со временем.

Концентрация используемого красителя, возможно, именно то, что вы стараетесь измерить. Проникновение в образец (или пространственная эксклюзия из образца) часто зависит от ионной силы и pH. Эффективное сечение поглощения — это измерение части потока фотонов возбуждения, поглощаемых молекулой красителя. Оно зависит от способа связывания пробы, pH, концентрации специфических ионов и ионной силы.

Квантовый выход характеризует вероятность того, что поглощаемая энергия фотона возбуждения, будет испущена повторно в виде флуоресцирующего фотона. Квантовый выход сильно зависит от длины волны. На него также влияют pH, концентрация специфических ионов, ионная сила и взаимодействие красителя с белком. Насыщение синглетного состояния происходит, когда лазерное излучение мощностью более одного милливатта используется с объективом высокой числовой апертуры. В этом случае интенсивность света достаточна, чтобы перевести все молекулы красителя в сечении луча в возбужденное состояние, что приводит к падению квантового выхода красителя.

Под загрузкой подразумевается количество красителя, которое вы внесли в клетку. Важными переменными являются количество молекул/антител красителя, или другого маркера белка, а также используемая процедура связывания/проникновения. Тушением (подавлением сигнала) называется поглощение флуоресцентного свечения молекулы красителя соседними с ней молекулами. Под разгрузкой подразумевается изъятие находящегося в клетке красителя или его инактивация каким-либо способом.

Скорость реакции с субстратом относится к красителям с такими флуоресцентными свойствами, благодаря которым они взаимодействуют с ионами и другими молекулами клетки. Время задержки на пикселе составляет микросекунды, и этого может быть недостаточно для достижения равновесия. Предварительным обесцвечиванием называется обесцвечивание перед проведением текущего измерения.

Компартментализацией (пространственное разделение) называется перераспределение красителя под действием внутриклеточных процессов. К взаимодействиям краситель/краситель относится не только вышеупомянутое тушение, но и резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET). Это происходит, когда спектр испускания одного красителя перекрывается спектром поглощения второго, молекула которого находится рядом (на расстоянии нескольких нанометров). FRET может привести к испусканию света только на длине волны испускания второго красителя. Если вторая молекула не флуоресцентна, как обычно бывает, флуоресценция теряется или тушится. Влияние красителя на образец может проявляться в изменении многих параметров, включая снижение жизнеспособности образца.

Показатель преломления образца (рисунок 1(d)) и его среда для заливки определяют величину сферической аберрации. Даже при наблюдении биологических образцов в водной среде с помощью объектива с водным наполнением, соответствие далеко от совершенного, или даже близкого. Сферическая аберрация этого типа — основная причина потерь сигнала с увеличением глубины проникновения.

Важно, чтобы используемое иммерсионное масло имело соответствующий показатель преломления и дисперсию (изменение показателя преломления в зависимости от длины волны). Наличие воздушных пузырей, проявляющих себя как линзы, в иммерсионной среде не допускается. Убедиться в их отсутствии можно с помощью линзы Бертрана, используемой для выравнивания фазовых колец.

Нахождение клетки в живом состоянии может влиять на эксперимент, поскольку размер, форма и ионное окружение живой клетки отличны от мертвой. Автофлуоресценция связана с наличием эндогенных флуоресцентных соединений. Эффективность этих молекул может меняться с изменением pH, ионной концентрации и метаболического состояния. Побочная автофлуоресценция может быть связана с неправильным связыванием, особенно при использовании глутаральдегида.

Преломляющие структуры или органеллы между объективом и фокальной плоскостью, например, сферические липидные глобулы, могут перефокусировать луч в совершенно неизвестное положение. Меньшие структуры имеют меньший эффект, но любая структура, рассеивающая луч, уменьшает интенсивность фокусного пятна, а следовательно и принимаемого сигнала. Их кумулятивный эффект тоже вносит вклад в отображение клеток, показатель преломления которых гораздо выше, чем у воды.

Присутствие или отсутствие сильно окрашенных структур выше или ниже фокальной плоскости влияет на разрешение по оси z. Большие структуры, если они сильно окрашены, могут поглощать большую долю потока облучения.

Сигнал, проходящий через точечное отверстие (точечную диафрагму) (рисунок 1(e)), пропорционален квадрату диаметра точечного отверстия (или ее размера), который обычно полагается равным диаметру диска Эйри в плоскости точечного отверстия. Большое значение имеет юстировка: изображение лазера, сфокусированное на образце и рефокусированное оптической системой обратно, должно совпадать с центром точечного отверстия.

В качестве приемника излучения (рисунок 1(f)) обычно используется фотоумножитель (ФЭУ). Принимаемый сигнал прямо пропорционален квантовому выходу. Эффективный квантовый выход фотоумножителей, используемых в большинстве конфокальных микроскопов, падает от 15 процентов в синем конце спектра до порядка 4 процентов в красном. Что касается времени отклика, то большинство флуоресцентных сигналов умножаются быстро, но на другие, такие как трансмембранные токи, приемник реагирует медленно, из-за чего необходимо понижать скорость сканирования.

Напряжение ФЭУ определяет коэффициент его усиления. Возрастание напряжения на 50 вольт соответствует коэффициенту усиления 2. Необходимо иметь в виду, что регулировка темнового тока ФЭУ (или яркости) приводит к случайному усилению или уменьшению сигнала, приходящего на цифровой преобразователь. Темновой ток должен быть выставлен таким образом, чтобы уровень сигнала в самой темной части изображения был равен 5–10 единиц.

Существует много различных источников шумов, искажающих регистрируемое значение. В ФЭУ обычно присутствует шум темнового тока, но он обычно мал по сравнению с уровнем сигнала. Но это в меньшей степени верно для ФЭУ, работающих в красной спектральной обрасти, или при наблюдении слабо окрашенных образцов. Если не считать рассеянного света, который может случайно попасть в ФЭУ, основным источником шума в них остается пуассоновский или статистический шум. Он равен квадратному корню числа фотонов, зарегистрированных в данном пикселе. Это значит, что шум растет с ростом сигнала, даже если отношение сигнал-шум улучшается.

Оцифровка, обычно производимая компьютером (рисунок 1(g)), должна быть линейной. Уровень электронного сигнала, приходящего на цифровой преобразователь «8-битных» микроскопов, должен попадать в диапазон от 1 до 255. Значения от 10 до 220, учитывая наличие статистического шума, являются более безопасными. Коэффициент цифрового преобразования характеризуется соотношением между числом зарегистрированных фотонов и записываемым числом. Он зависит от напряжения ФЭУ и других характеристик усиления, но для нормальных образцов, регистрируемых на 8-битных приборах, приблизительно равен 30. Имейте в виду: для того, чтобы аккуратно измерить один из этих параметров, остальные 38 должны сохраняться постоянными.

Возврат к списку